Decellularizing human colorectal cancer matrices as a 3D-organotypic model to evaluate macrophage differentiation

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Os tumores são microecossistemas complexos compostos por células tumorais, componentes da matriz extracelular (MEC) e outros tipos celulares. A interacção entre as células tumorais e os ambientes que as rodeia é crucial na progressão tumoral. Os macrófagos foram já descritos como sendo elementos essenciais no processo tumorigénico, podendo prevenir a invasão e disseminação das células tumorais – macrófagos do tipo M1 – ou promovendo o crescimento e progressão tumorais – macrófagos do tipo M2. Considerando os macrófagos como células com elevada plasticidade funcional, não é de excluir a possibilidade de as células tumorais explorarem esta característica em seu benefício. Torna-se então fundamental perceber de que forma o microambiente tumoral colorectal, particularmente componentes da MEC, influenciam a diferenciação macrofágica. Com este trabalho, pretendemos criar um modelo organotípico tridimensional que nos permita elucidar o mecanismo através do qual a MEC contribui para a diferenciação e polarização dos macrófagos. Para isto, começámos por optimizar o protocolo de descelularização, usando fragmentos de tecido normal e tumor colorectais. A quantificação de ADN e coloração com DAPI confirmaram a eficiência do método de descelularização usado. Coloração com hematoxilina/eosina e Masson Tricrómio demonstraram que os fragmentos descelularizados retêm as características histológicas dos tecidos nativos. Análise por microscopia electrónica (SEM) em matrizes descelularizadas normais, permitiu a visualização das fibras da MEC formando uma rede, sem que fossem visíveis células. Em relação às matrizes tumorais descelularizadas, a rede aparenta ser mais densa e, eventualmente, mais desorganizada. No entanto, em alguns casos excepcionais de matrizes tumorais descelularizadas, foi possível observar algumas fibras musculares e uma quantidade residual de caderina-E. O protocolo de descelularização resultou numa redução muito significativa da quantidade de glicosaminoglicanos, em ambos as matrizes, apesar de outros componentes da MEC, nomeadamente colagénios tipo I e IV, laminina e fibronectina, estarem preservadas. Estas matrizes foram depois repopuladas com monócitos, isolados a partir de sangue humano. Recorrendo a esta estratégia, conseguimos desenvolver um modelo inovador para estudar as interacções celulares e moleculares estabelecidas entre os elementos do microecossistema tumoral. No futuro, temos a expectativa de ajudar a esclarecer o papel dos componentes da MEC tumoral na diferenciação e polarização macrofágica, contribuindo para desenhar novas estratégias terapêuticas que tenham como alvo os macrófagos.Tumours are highly complex microecosystems composed of cancer cells, extracellular matrix (ECM) components and other cell types. The molecular crosstalk established between cancer cells and the surrounding environment is crucial for tumour progression. Macrophages have been described as key elements in this process, preventing the establishment and spreading of cancer cells – M1 macrophages – or supporting tumour growth and progression – M2 macrophages. Knowing that macrophages are highly plastic cells, it is possible that tumours explore this characteristic in their benefit. It is therefore important to unravel how the colorectal tumour microenvironment, namely ECM components, affects macrophage differentiation. In this work, we are particularly interested in creating a 3D-organotypic model that will allow us to elucidate how the ECM contributes to macrophage differentiation and polarization. To achieve this goal, we started by optimizing a decellularization protocol, for both normal and tumour colorectal fragments. DNA quantification and DAPI staining confirmed the efficiency of the decellularization method. Staining with Hematoxylin Eosin and Masson’s Trichrome revealed that decellularized fragments retain the histological features of the tissues. SEM analysis of normal decellularized matrices allowed the visualization of the ECM fiber meshwork, without any visible cells. In tumour matrices, the matrix was denser and seemed to be more disorganized. Nevertheless, in certain tumour decellularized fragments, it was visible the presence of some muscle fibers and a residual E-cadherin staining. Decellularization reduced significantly the glycosaminoglycans (GAGs) content in normal and tumour matrices but other ECM components, such as collagens type I and IV, laminin and fibronectin were retained. These matrices were then repopulated with freshly isolated monocytes and allowed to differentiate for different timepoints. With this strategy, we were able to develop an innovative model that allows studying of the complex interplay established at the tumour microecosystem. In the future, we expect to help elucidating the role of tumour ECM components on macrophage differentiation and polarization, contributing to the design of novel therapeutic strategies targeting macrophages