Tracking dendritically synthesized proteins induced by synaptic activity

Tese de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraEm 1973 foi descrito pela primeira vez um aumento abrupto e continuado da eficácia na transmissão sináptica no hipocampo denominado LTP (do inglês long-term potentiation). O LTP foi descoberto em todas as vias excitatórias do hipocampo sugerindo o seu envolvimento em certas formas de memória. A plasticidade sináptica refere-se à capacidade de modificar a eficácia da transmissão sináptica. Estas mudanças podem ser a curto ou longo prazo, e são dependentes de actividade. Modificações a longo prazo exigem a síntese de novas proteínas, o que pode ocorrer localmente em sinapses estimuladas. Usando Dendra2, foram criadas fusões com as proteínas associadas à plasticidade sináptica cujos mRNAs são localizados nas sinapses (como CaMKII, Arc e calmodulina). Quando traduzidsa, estas proteínas fusão vão exibir fluorescência verde, que pode ser convertido irreversivelmente para a sua forma vermelha, permitindo-nos distinguir entre proteína produzidas de novo e pré-existentes. Assim, somos capazes de seguir a síntese local e tráfico posterior destas proteínas após atividade sináptica. A plasticidade sináptica refere-se especificamente à modificação da eficácia da transmissão sináptica de forma dependente da actividade em sinapses preexistentes. Estas alterações na eficácia sináptica podem resultar na potenciação (aumento da eficácia sináptica), ou na depressão (decréscimo na eficácia sináptica) da transmissão sináptica conhecido como potenciação de longo prazo (LTP), oudepressão a longo prazo (LTD), respectivamente. As alterações celulares, tais como LTP e LTD são geralmente classificados de curto prazo (E-LTP/LTD), com base na modificação pós-tradução das proteínas pré-existentes, ou a longo prazo (L-LTP/LTD), se há necessidade de síntese de novas proteínas. Foi demonstrado que, a curto prazo a plasticidade sináptica é insensível aos inibidores de tradução da proteína, contrariamente à fase a longo prazo que é sensível ao bloqueio por esses inibidores, mostrando a sua dependência na síntese de novas proteínas. A síntese proteíca local requer mRNAs, polirribossomas e um todo o complexo de organelos secretores, que se demonstrou recentemente estarem presente nas dendrites, frequentemente a centenas de microns do corpo da célula. Vários mRNAs individuais têm sido encontrados nas dendrites e transcritos codificam proteínas que parecem ser importantes para a plasticidade sináptica e se localizam na região pós-sináptica. CaMKII, calmodulina, Arc e GluA1 são algumas das proteínas candidatam a serem traduzidas nestes polirribossomas localizados nas dendrites. Neste estudo pretende-se compreender se a actividade pode levar à tradução de proteínas com mRNAs localizadas nas dendrites, e se estes estão disponíveis localmente para sinapses próximas. Para responder a esta questão, temos desenhado e construído sondas contendo proteínas nativas fundidas com a proteína fotoconvertível Dendra2-C, uma proteína que é verde, na sua forma nativa e quando exposta à luz UV é convertida para uma forma vermelha. Esta proteína fluorescente vai nos permitir distinguir entre proteínas preexistentes e recém-sintetizado após a estimulação sináptica e também para acompanhar o papel destas proteínas sinápticas na plasticidade sináptica.In 1973, the first description of an abrupt and sustained increase in the efficiency of synaptic transmission called long-term potentiation (LTP) in the hippocampus was described. LTP has since been found in all excitatory pathways in the hippocampus leading to the idea that it underlies certain forms of memory. Synaptic plasticity refers to the ability to modify the efficacy of synaptic transmission. These changes can be short or long-term, and are activity-dependent. Long-term modifications require new protein synthesis, which may occur locally on stimulated synapses. Using Dendra2, we have made fusions with selected plasticity proteins whose mRNAs are synaptically localized (such as CaMKII, Arc and Calmodulin). When translated, these will fluoresce green but can be converted to a red form, allowing us to distinguish between newly made and pre-existing pools. Thus, we monitor the local synthesis and subsequent trafficking of these proteins upon synaptic activity. Synaptic plasticity refers specifically to the activity-dependent modification of the efficacy of synaptic transmission at preexisting synapses. These changes in synaptic strength can result in either potentiation (increase in synaptic efficacy) or depression (decrease on synaptic efficacy) of synaptic transmission, known as long-term potentiation (LTP) or long-term depression (LTD), respectively. The cellular changes such as LTP and LTD are usually classified as either short-term (E-LTP/LTD), based on the posttranslational modification of preexisting proteins, or long-term (L-LTP/LTD), if they require new protein synthesis. It was shown that whereas the short-term phase of synaptic plasticity is insensitive to protein translation inhibitors, the long-term phase is sensitive to blockade by these inhibitors, showing its dependence on the synthesis of new proteins. Local protein synthesis requires mRNA, polyribosomes and an entire complement of secretory organelles, which were recently shown to be present in some dendrites and throughout the dendritic arbor, often hundreds of microns from the cell body. Several individual mRNAs have been found in dendrites and these transcripts code for proteins that seem to be important for synaptic plasticity and they localize in postsynaptic structures. CaMKII, Calmodulin, Arc and GluA1 are some of the candidates proteins found to be translated in these dendritically localized polyribosomes. In this study we aim to understand whether activity can lead to the translation of proteins with dendritically localized mRNAs, and whether these are locally available to synapses following activity induced translation. For this question, we have designed and constructed probes containing native proteins fused to the photoconvertible protein Dendra2-C; a protein that is green in its native form and when exposed to UV-light it is converted to a red form. This fluorescent protein will allow us to have a time-stamp to distinguish between preexisting and newly synthesized proteins after synaptic stimulation and also to follow the role of these synaptic proteins in synaptic plasticity