Vitamina C e Quimiotereapia : uma potencial sinergia contra o carcinoma colo-retal

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.A Vitamina C, também conhecida como ácido ascórbico, é uma vitamina essencial que atua como antioxidante e cofator de várias enzimas. Em concentrações farmacológicas, o ácido ascórbico (AA) exerce efeitos citotóxicos seletivamente em células tumorais devido à citotoxicidade induzida pelo peróxido de hidrogénio (H2O2) formado por reações mediadas pelo AA, o que pode levar à morte celular. Tem vindo a ser demonstrado que o AA não protege as células tumorais dos efeitos da quimioterapia mas consegue exercer esse efeito em células normais. Ao mesmo tempo, o AA em combinação com terapias convencionais induz o aumento do efeito inibitório do crescimento tumoral conferido pelas mesmas, independentemente do tipo de tumor. O 5- Fluorouracilo (5FU) é um dos compostos mais usados no tratamento de primeira linha do cancro colo-retal. Atendendo aos resultados positivos relativos à utilização de AA com a quimioterapia, o objetivo deste trabalho é avaliar especificamente a existência de efeito sinérgico e potencial terapêutico da combinação de AA e 5FU em três linhas celulares humanas de cancro do cólon. Numa primeira fase avaliou-se o efeito citotóxico do AA através do ensaio colorimétrico do SRB, ensaios clonogénicos, citometria de fluxo, sendo também analisada a ocorrência de danos ao nível do DNA através do ensaio cometa. O efeito do 5FU na proliferação celular foi avaliado através do ensaio SRB. Depois de confirmada a citotoxicidade induzida pelo AA e 5FU quando administrados isoladamente, foi avaliada a citotoxicidade induzida pela combinação de ambos os compostos através do ensaio SRB, ensaios clonogénicos e citometria de fluxo. O desenho experimental utilizado permitiu avaliar a presença de efeito sinérgico entre os dois compostos através do cálculo do índice de combinação. Os resultados demonstram que o AA isoladamente inibe a proliferação e induz morte celular nas linhas de cancro do cólon. Este facto foi associado com alterações ao nível das espécies reativas de oxigénio nas células C2BBe1 e WiDr. A terapia combinada resultou num efeito sinérgico em algumas condições e permitiu a diminuição da concentração de 5FU necessária para reduzir a proliferação celular em 50% (IC50). Apesar de não terem sido observadas diferenças significativas ao nível da viabilidade e morte celular com as combinações de doses estudadas, verificou-se que a terapia X combinada induz um atraso do ciclo celular diferente do atraso que se observa com a administração de cada composto individualmente.Vitamin C, also known as ascorbic acid, is an essential vitamin acting as antioxidant and cofactor for various enzymes. At pharmacological concentrations, ascorbic acid (AA) exerts cytotoxic effects selectively on tumor cells due to hydrogen peroxide (H2O2) production mediated by AA, which can induce cancer cell death. It has been proved that AA doesn’t protect cancer cells from chemotherapy but plays a protective role in normal cells. At the same time AA can enhance tumor growth inhibitory effect conferred by usual therapies regardless tumor type. 5-Fluorouracil (5FU) is one of the most widely used agents in the first-line therapy of colorectal cancer. Giving the positive feedback in turn of the use of AA with chemotherapy, the aim of this study is to specifically evaluate the existence of synergistic effect and therapeutic potential in the combination of AA and 5FU in three human colon cancer cell lines. First of all the cytotoxicity effect of AA was evaluated by the SRB colorimetric and clonogenic assays, flow cytometry, as well as the occurrence of DNA damage in WiDr cell line through comet assay. It was also analysed the effect of 5FU on cell proliferation by SRB assay. After confirming AA and 5FU induced cytotoxicity when administered alone, it was evaluated the cytotoxicity induced by the combination of both compounds by the SRB assay, clonogenic assays and flow cytometry. The experimental design allowed to evaluate the presence of synergistic effect between both compounds by combination index determination. The results demonstrate that AA as a single agent inhibits cell proliferation and induces cell death in the colon cancer cell lines. This fact was associated with changes in reactive oxygen species in C2BBe1 and WiDr cells. The combination therapy resulted in a synergistic effect in some conditions and allowed the reduction of the 5FU half maximal inhibitory concentration (IC50). Although no significant were observed in cell viability and death for the studied conditions, the combination therapy led to cell cycle arrest different from that observed with both compounds alone