The Role of Transmembrane AMPA Receptor Regulatory Proteins (TARPs) in Synapse Remodeling and Homeostatic Plasticity

Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Durante o desenvolvimento do sistema nervoso central o refinamento dos circuitos neuronais é primariamente controlado por mecanismos de plasticidade de Hebb. No entanto, esta plasticidade tende a destabilizar os circuitos neuronais, levando a um descontrolo da excitabilidade neuronal. Existem evidências convincentes na literatura do controlo homeostático da excitabilidade neuronal em diversos sistemas. Conhecem-se algumas das vias de sinalização que controlam a plasticidade homeostática, mas os mecanismos moleculares que regulam este processo permanecem uma área de investigação activa. Neste trabalho testámos o papel da stargazina, uma proteína da família das proteínas transmembranares que interagem com os receptores do glutamato do tipo AMPA (TARPs), na plasticidade sináptica homeostática. Para isso, investigámos de que modo a perda da função da stargazina afecta o scaling sináptico induzido por tetrodotoxina (TTX) em culturas de neurónios corticais. Descobrimos que o bloqueio crónico da actividade com TTX aumenta os níveis de stargazina bem como a sua fosforilação, causando acumulação sináptica da stargazina que coincide com aumento da expressão superficial de receptores do glutamato do tipo AMPA (AMPAR), uma característica do mecanismo de plasticidade homeostática em resposta a inibição crónica da actividade neuronal. A fosforilação da stargazina está aumentada após bloqueio da actividade e regula o scaling sináptico já que a expressão de mutantes para a fosforilação da stargazina, S9A e S9D, impede a acumulação sináptica da subunidade GluA1 dos receptores AMPA. Demonstrámos também o envolvimento das proteínas cinase PKC e CaMKIIβ no scaling sináptico sendo a stargazina um substrato destas cinases. O estudo do papel da stargazina na plasticidade dependente de actividade da sinapse retinogenicular envolveu a caracterização do desenvolvimento desta xiv sinapse nos ratinhos stargazer. Descobrimos que a stargazina é essencial para a manutenção sináptica e plasticidade dependente de actividade, já que os ratinhos stargazer apresentam um defeito na maturação da sinapse retinogenicular no período sensível à visão. Analisámos ainda os níveis de TARPs e das subunidades dos AMPAR no núcleo geniculado lateral (dLGN) após diferentes manipulações visuais. É importante ressaltar que os níveis de stargazina são regulados pela visão, e estão aumentados no tálamo visual quando os ratinhos são privados de visão entre p20-27 (LDR-late dark rearing), sem se registarem alterações noutro membro das TARPs, a TARPγ4. Finalmente, descobrimos que, de acordo com o que foi descrito anteriormente (Gainey et al. 2009), o bloqueio crónico da actividade de neurónios corticais aumenta a expressão da subunidade GluA2. Esta subunidade está também aumentada no dLGN após LDR, demostrando que haverá semelhantes efectores moleculares da plasticidade homeostático in vitro e in vivo. De acordo com o nosso conhecimento, esta é a primeira evidência de indução de plasticidade homeostática em regiões sub-corticais em resposta à privação de visão binocular. Com base nos nossos resultados propomos um modelo em que a fosforilação da stargazina é o interruptor principal para a acumulação sináptica de AMPAR durante a plasticidade homeostática, uma forma de plasticidade essencial para o desenvolvimento de circuitos e adaptação ao ambiente. O nosso trabalho mostra a stargazina como um novo regulador da homeostase dos circuitos.Activity-dependent synaptic refinement during development occurs primarily through Hebbian mechanisms of plasticity. However, this plasticity tends to destabilize the neuronal circuits leading to runway excitation or inhibition. There is now compelling evidence from a number of systems for homeostatic control of firing rates in central neurons. Molecular control of homeostatic processes is an active area of research. We tested whether stargazin participates in homeostatic synaptic plasticity by investigating how loss of stargazin function affects TTX-induced synaptic scaling in cultured cortical neurons. We found that chronic activity blockade with TTX increased stargazin levels and stargazin phosphorylation state, leading to increased synaptic stargazin accumulation coincident with increased surface expression of AMPA-type glutamate receptors, a hallmark of homeostatic plasticity induced by chronic inhibition of neuronal activity. Stargazin phosphorylation was increased upon chronic activity blockade and regulates synaptic scaling as expression of stargazin phospho-mutants, S9A and S9D, disrupted increased surface expression of GluA1, an AMPA receptor subunit. We were also able to show the involvement of PKC and CaMKIIβ in synaptic scaling. The role of stargazin in experience-dependent plasticity was studied by characterizing the development of the retinogeniculate synapse of stargazer mice. We found that stargazin is essential for synaptic maintenance and experiencedependent plasticity, as stargazer mice showed disrupted retinogeniculate synapse maturation at the vision sensitive period. Furthermore, we biochemically analyzed TARPs and AMPA receptor subunits in the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) after different visual manipulations. Importantly, stargazin levels are regulated by vision, and stargazin was up-regulated in the visual thalamus when experiencexvi dependent plasticity was induced by late-dark rearing, without significant changes in the thalamus-expressed family member TARPγ4. Finally, we found that, similarly to what was previously described (Gainey et al. 2009) and confirmed in our in vitro system, GluA2 subunit is increased in dLGN after late dark-rearing mice, showing similar molecular effectors of homeostatic plasticity in vitro and in vivo. To our knowledge this is the first evidence for homeostatic plasticity mechanisms being induced in sub-cortical regions in response to binocular visual deprivation. Herein we propose a model for stargazin phosphorylation as the main switch controlling AMPAR synaptic accumulation and trapping during homeostatic plasticity. This form of plasticity is essential for circuit development and adaptation to the ever-changing environment, making stargazin a new regulator of circuit homeostasis