Translational regulation mediated by internal ribosome entry sites of the MTOR and Δ133P53 human transcripts

Tese de doutoramento em Biociências, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraA regulação ao nível da iniciação da tradução de mRNAs é fundamental no processo de controlo de expressão génica uma vez que permite uma resposta celular rápida face a estímulos externos. Este controlo pode ocorrer de forma específica de transcrito, através de elementos reguladores em cis, tais como internal ribosome entry sites (IRESs), que medeiam a tradução de forma independente de alguns factores de iniciação canónicos que são inibidos em condições de stress celular, ou em algumas condições fisiológicas ou patológicas. Desta forma, a tradução dependente de IRES é refractária a condições que inibem a síntese proteica global. Estes elementos encontram-se em transcritos que codificam proteínas responsivas a stress, oncogenes ou supressores de tumor. O trabalho apresentado nesta dissertação mostra que os transcritos que codificam o mammalian (or mechanistic) target of rapamycin (MTOR) e a isoforma proteica de P53, Δ160P53, possuem elementos IRESs a regular a sua expressão. O MTOR é uma serina/treonina quinase conservada que integra sinais provenientes da estimulação por factores de crescimento, assim como dos estados nutricional e energético da célula actuando, nomeadamente, na maquinaria de tradução. Apesar da crescente compreensão acerca dos mecanismos de regulação e efeitos da via de sinalização do MTOR, o controlo da sua própria expressão, nomeadamente ao nível da tradução, permanece largamente desconhecido. Os resultados descritos nesta tese demonstram que a região 5´ transcrita e não traduzida (5’UTR) do mRNA MTOR humano contém um elemento IRES que permite a sua tradução de forma independente da estrutura cap. Adicionalmente, demonstra-se que a tradução de MTOR mediada por IRES é estimulada em hipoxia com associado aumento da fosforilação de EIF2α e que esta estimulação é independente da indução de hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) per se.A fase anti-apoptótica da unfolded protein response induzida por stress do retículoendoplasmático (RE) estimula a tradução de MTOR mediada por IRES, contudo um efeito mais pronunciado é observado na fase pró-apoptótica com associado aumento da fosforilação de EIF2α. Mostra-se ainda que a inactivação de MTORC1 é acompanhada por estimulação do IRES do MTOR, sugerindo um circuito de auto-regulação com o intuito de manter os níveis proteicos de MTOR constantes. Estes resultados demonstram um novo mecanismo regulador da expressão génica de MTOR, que integra o rearranjo de perfil proteico observado em condições que inibem globalmente a tradução. Para além disso, os resultados aqui apresentados podem explicar o facto da via de sinalização do MTOR não ser perdida em condições que inibem a síntese proteica. A proteína P53 possui papel fundamental no impedimento de desenvolvimento tumoral. Em condições de stress, P53 desenvolve um programa protector que, dependendo da severidade do stress e/ou dano causado, poderá promover a sobrevivência celular através da indução de uma paragem temporária do ciclo celular e da reparação dos danos ou promover a inviabilização da célula através da indução de senescência celular ou morte por apoptose ou autofagia. O gene tumor protein p53 (TP53) expressa várias isoformas proteicas através da utilização de diferentes promotores, splicing alternativo ou tradução mediada por IRES, que actuam tanto através da modulação da actividade da proteína P53 como de forma independente desta. A sua função primordial na supressão da tumorigénese e o facto de TP53 ser um dos genes mais frequentemente mutados em cancro, faz com que este seja um dos genes mais estudados. Contudo, tem-se vindo a verificar que as funções da família de P53 ainda não são totalmente conhecidas e a descoberta de novos membros tem vindo a adensar a complexidade desta família.Recentemente foi descoberta uma nova isoforma proteica originada apartir de iniciação da tradução no codão 160, tendo sido designada por Δ160P53. Porém, o mecanismo responsável pela sua expressão assim como a sua função permaneceram um mistério. O trabalho explanado nesta dissertação mostra que a expressão de Δ160P53 é induzida por sobre-confluência celular e em stress do RE através de taxas de tradução aumentadas. Adicionalmente, é aqui identificado um elemento IRES a jusante do codão de iniciação 160, o qual é responsável pela expressão da isoforma proteica Δ160P53. Curiosamente demonstra-se que a 5´UTR de Δ160P53 inibe a actividade deste elemento IRES. Para além disso, mostra-se que o aumento da fosforilação de EIF2α estimula a síntese de Δ160P53 mediada por IRES. Na sequência deste trabalho, um grupo colaborador mostrou que a proteína Δ160P53 inibe a apoptose, promove crescimento celular e induz transformação maligna. O trabalho descrito nesta tese apresenta os IRESs que assistem a síntese de MTOR e Δ160P53 como potenciais novos alvos terapêuticos para o tratamento de várias doenças, tal como cancro, com hiper-activação da via de sinalização do MTOR e expressão aumentada de Δ160P53, respectivamente