Gene transfer approaches to study the role of adenosine A2A receptors in Machado-Joseph disease

Tese de doutoramento em Farmácia, na especialidade de Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa causada por uma repetição excessiva do trinucleótido CAG no gene MJD1/ATXN3 que se traduz numa expansão de uma repetição de glutaminas na proteína ataxina-3. Não existe actualmente nenhuma terapêutica que previna ou modifique a progressão da doença. No entanto, como a manipulação do sistema neuromodulador da adenosina, em particular do seu receptor A2A, se tem revelado eficaz no controlo e alívio da neurodegenerescência em diferentes patologias cerebrais, testámos agora a sua capacidade de controlar a neurodegenerescência associada à DMJ. Com este propósito, utilizámos diferentes modelos roedores animais de DMJ, nomeadamente o modelo baseado na introdução intra-cerebral de vectores lentivirais e num modelo transgénico, e averiguámos a eficiência do antagonismo dos receptores A2A, bem como da sua deleção genética e molecular nas modificações neuropatológicas e comportamentais associadas. A administração crónica de cafeína (por via oral) foi a estratégia escolhida dada a sua capacidade para antagonizar os receptores de adenosina, em particular os receptores A2A (Fredholm et al., 1999), de atravessar a barreira hematoencefálica e, graças ao seu perfil de segurança, de poder tornar-se uma estratégia profilática promissora para modificar a progressão da DMJ. No capítulo 2, modulámos a DMJ transduzindo o estriado de animais murinos adultos da estirpe C57Bl6 com vectores lentivirais codificando para a ataxina-3 mutante num hemisfério e para a ataxina-3 normal no hemisfério contralateral (como controlo interno), e administrámos cafeína (1 g/L) solubilizando-a na água de beber. Os nossos resultados evidenciam dois fenómenos precoces na DMJ, a sinaptotoxicidade e a gliose, e demonstram que a cafeína e a deleção genética dos receptores A2A diminuem a patologia estriatal associada à doença o que nos leva a considerar os receptores A2A como um potencial novo alvo terapêutico para tratar a DMJ. No capítulo 3, administrámos cafeína (1 g/L, na água de beber) em murganhos transgénicos da DMJ (TgDMJ) e testámo-los em vários paradigmas motores e não motores. Os animais TgDMJ apresentaram uma série de modificações motoras e cognitivas/ emocionais, tais como défices na movimentação fina, e na capacidade de aprendizagem bem como alterações de humor. Os nossos resultados mostram que a cafeína previne a perda progressiva da função motora, do equilíbrio e da força muscular, acompanhado por uma preservação da morfologia cerebelar e da normalização de um possível desequilíbrio nos circuitos dopaminérgicos. No capítulo 4, o modelo da DMJ murganho baseado na transdução estriatal de lentivírus codificando para a ataxina-3 mutante foi: i) seguido de tratamento por via oral com o composto KW6002, um antagonista selectivo dos receptores A2A; ou ii) paralelamente co-transduzido com vectores lentivirais que promoveram o silenciamento ou a sobre-expressão dos receptores A2A. A expressão da ataxina-3 mutante no estriado de murganho induziu uma perda extensa de imunoreactividade à proteína DARPP-32 seguida de uma clara condensação da cápsula interna do corpo estriado. O composto KW6002 reduziu a perda de DARPP-32 e preveniu a redução do corpo estriado. Por sua vez, o silenciamento dos receptores A2A nos neurónios GABAérgicos estriatais do tipo espinhosos médios não exerceu qualquer efeito na progressão da DMJ conquanto a sua sobre-expressão resultou numa tendência para a neuroprotecção. Os nossos resultados suportam o envolvimento directo dos receptores A2A na progressão da DMJ e evidenciam a existência de um papel distinto dos receptores A2A localizados nos compartimentos pré- e pós-sináptico estriatais, devendo este facto constituir uma preocupação especial na concepção de terapêuticas baseadas no antagonismo dos receptores A2A direccionadas para reduzir a patologia da doença de Machado-Joseph. Por fim, esta dissertação apresenta um conjunto de evidências que demonstram pela primeira vez que os receptores A2A constituem um novo alvo terapêutico que permite interferir com a evolução da DMJ.Este trabalho foi financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), bolsa de doutoramento com a referência SFRH/BD/33186/2007, Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE), Projecto PTDC/SAU-NEU/099307/2008, pelo Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph research fund, a National Ataxia Foundation e a Association Française pour les Myopathies