Passive permeation across the blood-brain barrier. Kinetics and thermodynamics of chlorpromazine interaction with lipid bilayers representative of endothelial cell membranes

Tese de doutoramento em Química (Química Biológica), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraA difusão passiva através da membrana celular é a principal via para a permeação de xenobióticos através de endotélios tight, tais como a barreira hemato-encefálica. A velocidade da permeação passiva através de bicamadas lipídicas de um dado fármaco é, portanto, um passo crítico na previsão da sua farmacocinética. Neste trabalho, foi realizado um estudo detalhado sobre a cinética e a termodinâmica da interacção da clorpromazina, um antipsicótico utilizado no tratamento da esquizofrenia, com membranas lipídicas compostas por diferentes misturas de lípidos. Utilizámos a calorimetria de titulação isotérmica, uma técnica muito eficiente para o estudo de interacções moleculares, que permite a medição do coeficiente de partição de moléculas entre o meio aquoso e a membrana, bem como dos parâmetros termodinâmicos associados a esta partição. A complexidade das membranas utilizadas neste estudo foi aumentada progressivamente, desde a bicamada simples de POPC puro até composições de lípidos características das monocamadas exterior e interior das células endoteliais. Os efeitos da presença de carga, de colesterol (Chol), de fosfolípidos com etanolamina (POPE) e de esfingomielina (SPM), bem como da coexistência de fases, foram avaliados na interacção de CPZ com as bicamadas lipídicas. A introdução de 10% molar de POPS carregado negativamente em membranas de POPC aumenta a partição da CPZ, devido à atracção electrostática entre as cargas opostas, sendo que a variação de entalpia torna-se mais favorável. Por outro lado, a presença de Chol aumenta a ordem das bicamadas e diminui fortemente a afinidade da CPZ para com a bicamada, tanto em termos da quantidade de CPZ que se associa com a membrana bem como da entalpia de interacção, que se torna desfavorável. Para membranas na fase líquida ordenada (POPC:SPM:Chol 1:5:4) observa-se um coeficiente de partição muito mais pequeno do que para as membranas na fase líquida desordenada, com uma contribuição entalpica muito desfavorável. A partir dos parâmetros obtidos para todas as bicamadas lipídicas estudadas, observa-se que a partição de CPZ em membranas na fase líquida desordenada tem uma contribuição entalpica significativamente favorável, enquanto que a associação de CPZ com membranas na fase líquida ordenada é somente impulsionada pelo aumento de entropia no sistema. Os coeficientes de partição obtidos permitiram o cálculo das afinidades de CPZ para com as diferentes membranas da célula e a previsão da concentração relativa de CPZ em cada pool de lípidos em equilíbrio. x A permeação passiva através de bicamadas lipídicas depende da afinidade do fármaco para com a membrana e também das constantes de velocidade para a interacção (inserção, desorpção e translocação). Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia que permite a caracterização quantitativa da constante de translocação através das membranas na fase líquida desordenada, usando ITC. Apresentamos também resultados preliminares sobre o uso desta técnica para obter as constantes de velocidade para inserção em e desorção de bicamadas lipídicas na fase líquida ordenada. Além disso, este trabalho oferece uma visão importante sobre a heterogeneidade de fases das misturas lipídicas caracterizadas. Os resultados obtidos com as misturas estudadas de POPC:SPM:Chol permitem a avaliação crítica dos diagramas de fases disponíveis na literatura. Também foram encontradas fortes evidências para a coexistência de fase líquida desordenada e líquida ordenada na mistura quaternária representante da monocamada citoplasmática da membrana, POPC:Chol:POPE:POPS 4:3:2:1. Adicionalmente, foram encontradas evidências de rearranjos estruturais nas membranas com POPS e/ou POPE, induzidos pela partição de compostos anfifílicos catiónicos, como a CPZ. Estes resultados podem ser relevantes para elucidar a comunicação estrutural entre as monocamadas exterior e interior da membrana plasmática, em função da hipótese da existência de rafts. Além disso, podem também contribuir para o entendimento dos efeitos da CPZ sobre a actividade dos transportadores de membrana, tais como a P-glicoproteína.Bolsa de doutoramento concedida pela FCT (SFRH/BD/38951/2007