Caracterização farmacológica da contracção intestinal induzida pela metformina

Dissertação de mestrado em Bioquimica apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraA metformina é um anti-hiperglicémico oral amplamente utilizado na terapêutica farmacológica da Diabetes Mellitus tipo 2. Esta biguanida diminui a libertação de glicose hepática e aumenta a sua captação nos tecidos periféricos (tecido adiposo e músculo esquelético). A diarreia é um dos sintomas gastrointestinais associados ao tratamento com metformina. Além disso, a diabetes tipo 2 é também responsável pela ocorrência destes sintomas per se. A diarreia diabética é, então, uma das consequências da neuropatia autonómica diabética que perturba o controlo e a função dos órgãos do tracto gastrointestinal, como o intestino. Contudo, a diarreia provocada pela metformina é independente da influência da doença. Neste sentido, para perceber os mecanismos farmacológicos associados à diarreia desencadeada pela metformina, pretendia-se caracterizar a resposta contráctil de segmentos de íleo de rato à metformina, através de estudos funcionais de contracção isométrica. Para tal, investigou-se a possível interferência do fármaco na componente neuronal, bem como nas componentes colinérgicas, nitrérgicas, histaminérgicas e serotoninérgicas. Para além disso, comparou-se o efeito contráctil da metformina no ileo isolado de ratos Wistar (controlo) com o observado no íleo isolado de ratos Goto-Kakizaki (GK), um modelo animal de Diabetes Mellitus tipo 2. As preparações biológicas de íleo foram colocadas em banhos de órgãos de 15 ml, ligadas a transdutores de força e mantidas a 37ºC, em solução fisiológica de Krebs-Henseleit arejada com carbogénio e sob a tensão basal de 29,4 mN. Inicialmente, os segmentos intestinais foram submetidos a acetilcolina exógena (100 μM) para obter directamente a contracção máxima do músculo liso do íleo e, desta forma, permitir a comparação dos resultados de experiências diferentes. Posteriormente, foram realizadas duas curvas não cumulativas frequência eléctrica-resposta e concentração-resposta à metformina (6-36 M). A primeira curva correspondeu à curva controlo onde a resposta contráctil do órgão à estimulação eléctrica de campo e/ou à metformina foi testada na ausência de qualquer composto, enquanto que na segunda curva, 15 minutos antes de cada estimulação/dose, foram adicionados os seguintes compostos: metformina (36 μM); hexametónio (300 μM), um antagonista dos receptores nicotínicos; tetrodotoxina (1 μM), uma neurotoxina bloqueadora dos canais de sódio sensíveis à voltagem; atropina (10 μM), antagonista não selectivo dos receptores muscarínicos; NG-nitro-L-arginina (250 μM), um inibidor da sintase do monóxido de azoto; mepiramina (1 μM), um antagonista/agonista inverso dos receptores histamínicos do tipo H1; metiotepina (1 μM), um antagonista não selectivo dos receptores 5-HT1, 5-HT2, 5-HT5, 5-HT6 e 5-HT7; SB 224289 (1 μM), um antagonista selectivo dos receptores 5-HT1B; ritanserina (1 μM), um antagonista não selectivo dos receptores 5-HT2; cetanserina (1 μM), um antagonista selectivo dos receptores 5-HT2A/2C; MDL 72222 (1 μM), um antagonista dos receptores 5-HT3; e reserpina (100 μM), um inibidor do transportador vesicular de monoaminas. Em todas as experiências foram utilizados segmentos controlo, aos quais se adicionaram apenas os solventes apropriados para cada composto. Relativamente às curvas frequência eléctrica-resposta, os segmentos foram sujeitos à estimulação eléctrica de campo a frequências crescentes de 1, 2, 4, 8 e 16 Hz (100 V de intensidade, 5 ms de largura do pulso) com o objectivo de activar intrinsecamente a componente nervosa do íleo. No entanto, nos estudos realizados em animais GK apenas foram efectuadas curvas concentração-resposta à metformina na ausência e na presença de ritanserina (1 μM). Paralelamente, foram executadas curvas concentração-resposta à 5-hidroxitriptamina (0,1-60 M) nos dois grupos de animais, controlo e diabéticos, na presença e na ausência de cetanserina (1 μM) ou ritanserina (1 μM). Para complementar o presente trabalho, foram realizados estudos histoquímicos e imunohistoquímicos com o intuito de determinar a micro-anatomia dos segmentos de íleo e a localização celular dos receptores serotoninérgicos dos subtipos 5-HT1B, 5-HT1D e 5-HT2A. A metformina, testada em concentrações terapêuticas (6-36 M), induziu contracções dependentes da concentração nos segmentos de íleo isolado de rato (Emáx of 12.20 ± 0.80 mN, n=48; pEC50 of 4.89 ± 0.03, n=47). A metformina (36 M) não alterou significativamente a resposta contráctil dos segmentos à estimulação eléctrica de campo, o que sugere um mecanismo de acção não neuronal. Estes resultados foram confirmados pela ausência de alterações na curva concentração-resposta da metformina na presença de hexametónio e tetrodotoxina, excluindo o envolvimento da componente nervosa autonómica colinérgica e não colinérgica. Para além disso, as curvas concentração-resposta da metformina não foram alteradas significativamente na presença de atropina ou de NG-nitro-L-arginina, excluindo o envolvimento de receptores muscarínicos ou a inibição da produção de monóxido de azoto. A mepiramina, um antagonista/agonista inverso dos receptores H1, alterou significativamente a contracção induzida pela metformina. Relativamente aos receptores serotoninérgicos, a cetanserina, o SB 224289 e o MDL 72222 não alteraram a contracção induzida pela metformina, o que sugere que os receptores 5-HT2A/2C, 5-HT1B e 5-HT3 não estão a mediar a resposta contráctil. Tanto a metiotepina como a ritanserina reduziram substancialmente a contracção intestinal induzida pela metformina, o que comprova o envolvimento de receptores serotoninérgicos presentes nas células das camadas de músculo liso, nomeadamente, os receptores 5-HT2B. Os efeitos da cetanserina e da ritanserina na curva concentração-resposta à metformina também foram observados em curvas concentração-resposta à 5-hidroxitriptamina. A acção pós-sináptica da 5-HT não pareceu alterada sob influência da doença, uma vez que o efeito da ritanserina em ratos GK foi semelhante ao observado em ratos Wistar. Contudo, no modelo animal diabético, a redução da resposta contráctil à metformina pela ritanserina apenas se revelou significativa na última dose da curva concentração-resposta. A reserpina alterou significativamente a contracção intestinal induzida pela metformina em ratos Wistar, sugerindo que o fármaco induz a libertação de 5-hidroxitriptamina a partir das células enterocromafins presentes na mucosa intestinal. Adicionalmente, os estudos imunohistoquímicos revelaram a presença de receptores 5-HT2A não nas camadas musculares mas nas células ganglionares do plexo mientérico, para além de perturbações morfológicas motivadas pela diabetes tipo 2 nos ratos GK. Em conclusão, os resultados obtidos permitem reforçar a relação entre a incidência de diarreia e a terapêutica com metformina, graças ao seu perfil farmacológico de contracção intestinal que é mediado principalmente por uma forte componente serotoninérgica.Metformin is an oral antihyperglycemic agent widely used in the treatment of type 2 Diabetes Mellitus. This biguanide decreases hepatic glucose output and increases cell glucose uptake in peripheral tissues (adipose tissue and skeletal muscle). Diarrhea is one of the gastrointestinal side effects commonly reported with metformin treatment. In addition, type 2 diabetes is also responsible for the occurrence of these symptoms per se. Diabetic diarrhea is then a consequence of diabetic autonomic neuropathy which impairs control and functioning of gastrointestinal organs such as the intestine. However, metformin-induced diarrhea is independent of the pathological status. To understand the pharmacological mechanisms associated with the metformin-induced diarrhea, we intended to characterize the contractile response of rat isolated ileum segments to metformin, through functional studies of isometric contraction. Therefore, we investigated the possible drug effect in the neuronal, cholinergic, nitrergic, histaminergic and serotonergic ileum components. Thus, we compared the contractile effect of metformin on control Wistar rats with that of Goto-Kakizaki (GK) rats, an animal model of type 2 diabetes. The ileum segments were suspended in 15 ml organ baths, attached to force transducers and maintained at 37°C in aerated Krebs-Henseleit solution at a basal tension of 29.4 mN. Initially, preparations were submitted to exogenous 100 μM acetylcholine to directly obtain the ileum smooth muscle maximal contraction in order to compare the results from different experiments. Two non-cumulative electrical frequency-response and concentration-response curves to metformin (6-36 M) were performed. The first curve corresponds to the control curve, where the contractile response to electrical field stimulation and/or metformin was tested in the absence of any compound, while in the second curve, the following compounds were added 15 min before each dose of metformin or electrical stimulation frequency: metformin (36 M); hexamethonium (300 M), a nicotinic receptor antagonist, tetrodotoxin (1 M), a selective blocker of Na+ voltage-sensitive channels which inhibits impulses propagation in neuron excitable membranes; atropine (10 M), a non-selective muscarinic receptor antagonist; NG-nitro-L-arginine (250 M), a nitric oxide synthase inhibitor; mepyramine (1 M), a histamine H1 receptor inverse agonist/antagonist; methiothepin (1 M), a non-selective antagonist of the 5-HT1, 5-HT2, 5-HT5, 5-HT6 and 5-HT7 receptors; SB 224289 (1 M), a selective 5-HT1B receptor antagonist; ritanserin (1 M), a non-selective 5-HT2 receptor antagonist; ketanserin (1 M), a selective 5 -HT2A/2C receptor antagonist; MDL 72222 (1 M), a 5-HT3 receptor antagonist and reserpine (100 M), a vesicular monoamine transporter inhibitor. In each assay, control segments were used with the appropriate solvent of each drug. Frequency-response curves were obtained through electrical field stimulation (1, 2, 4, 8 and 16 Hz, 100 V, 5 msec pulse width) in order to activate intrinsic ileum nerves. However, only concentration-response curves to metformin in the presence and in the absence of ritanserin (1 M) were performed in GK rat functional studies. Concentration-response curves to 5-hidroxytryptamine (0.1-60 M) in the presence and in the absence of ketanserin (1 M) or ritanserin (1 M) were also performed in both groups of diabetic and control animals. Histochemical and immunohistochemical studies were carried out in order to determine the micro-anatomy and the cellular localization of 5-HT1B, 5-HT1D and 5-HT2A receptors. Metformin, used in therapeutic concentrations (6-36 M), caused concentration-dependent contractions of rat isolated ileum segments (Emax of 12.20 ± 0.80 mN, n=48; pEC50 of 4.89 ± 0.03, n=47). Metformin (36 μM) did not significantly change the rat ileum frequency-dependent contractile response to electrical field stimulation suggesting a non-neuronal mechanism of action. This was confirmed by the unchanged concentration-response curve to metformin in the presence of hexamethonium and tetrodotoxin, excluding the involvement of autonomic cholinergic and non-cholinergic nerves. Moreover, the metformin concentration-response curves were not significantly altered by atropine nor by NG-nitro-L-arginine, excluding the involvement of muscarinic receptors or the inhibition of nitric oxide production alone. Mepyramine, a H1 histaminic receptor antagonist/inverse agonist, did significantly change the metformin-induced contraction. Concerning the serotonergic receptors, ketanserin, SB 224289 and MDL 72222 did not changed the metformin-induced contraction, which means that 5-HT2A/2C, 5-HT1B and 5-HT3 receptors do not mediate the contractile response. Methiothepin and ritanserin almost abolished the metformin-induced intestinal contraction, which proves the involvement of serotonergic receptors present on the smooth muscle cells layers, namely 5-HT2B receptors. The effects of ketanserin and ritanserin on the metformin concentration-response curve were also observed on the 5-hidroxytryptamine concentration-response curve. The 5-HT post-synaptic action did not seem impaired under the influence of the disease, since the effect of ritanserin in GK rats was similar to that of Wistar rats. However, in the diabetic animal model, the ritanserin reduction of the metformin-induced intestinal contraction only became significant at the last metformin dose of the concentration-response curve. Reserpine significantly changed the metformin-induced contraction in Wistar rats, indicating that metformin triggers 5-hidroxytryptamine release from enterochromaffin cells of the rat intestinal mucosa. Furthermore the immunohistochemical studies did not reveal the presence of 5-HT2A receptors in the smooth muscle layers but in the myenteric plexus ganglionic cells, in addition to morphological disturbances driven by type 2 diabetes in GK rats. In conclusion, our experiments allowed us to reinforce the gastrointestinal side effects associated with metformin treatment since it induces intestinal contraction mainly by serotoninergic ways