Drug delivery systems for tissue engineering applications

Tese de Doutoramento em Engenharia Química (Processos Químicos), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbrafirst commercial devices composed of poly(ethylene-co-vinyl acetate). Since then, the field has suffered a tremendous evolution. As the knowledge on cell biology, physiology and materials sciences increased, better approaches were developed. Today we stand on the nanometric level of controlled delivery devices. These approaches rely on highlyinnovative materials, with increasing biological accuracy, having has an ultimate goal the achievement of personalised medicine. Impaired-angiogenesis associated pathologies, such as ischemic heart disease, chronic wounds or stroke, have a high-burden on society. Pro-angiogenic therapies aim at recovering vascularised impaired tissues. Among other approaches, the use of specific growth factors, like vascular endothelial growth factor (VEGF), is one of the most attempted approaches found on the literature. However, the results in clinical trials, using bolus delivery of VEGF, did not meet the desired therapeutic efficacy. Part of this failure was attributed to suboptimal delivery strategies, allied to the short half-life and fast clearance rates of the growth factor. Cardiovascular diseases and wound healing are huge ummet medical needs which would benefit tremendously of successful delivery strategies for VEGF. We have previously synthesised and characterised oxidised dextran (dexOx) hydrogels (Maia et al. Polymer 2005;46:9604-9614). We have used this system as a benchmark and continued its characterisation in an attempt to improve it for the desired drug delivery approaches. A deeper analysis of oxidised dextran was performed, focused on the oxidation degree effect and its direct influence on the microscopic and macroscopic characteristics of the material. As a result, we observed how the oxidation degree strongly interferes with the viscosity of dexOx aqueous solutions and how the thermal degradation profiles, of the different samples, reflect the damage that low and mild oxidations could originate, on the polymeric backbone. DexOx cross-linked with adipic acid dihydrazide hydrogels were further characterised having in mind the future incorporation of a therapeutic biomolecule and the integration in more complex systems. Different geometries were approached, like microgels, of which we present some early studies. The natural reactivity of oxidised dextran toward N-nucleophiles render this vehicle appropriate for an effortless and straightforward conjugation with a proteinaceous growth factor, conferring protection and extending the protein half-life by inhibiting fast cellular consumption. VEGF is able to maintain its bioactivity, however the conjugation to dexOx, severely hinders the interaction with VEGF receptors and antibodies, delaying the VEGF consumption. The hydrogels release profile of VEGF was studied and observed to be quite different from other systems described on the literature. The initial burst release could be fine tuned from one to forty five percent of the total initial drug. Fibrin hydrogels were shown, elsewhere, to be appropriate carriers of endothelial cells. They improved the survival and proliferation of such cells. Therefore, a novel hybrid construct was designed. The dexOx hydrogels were entrapped inside the fibrin hydrogels. The combination of both platforms in a hybrid matrix supported the attachment of vascular cells and allowed their migration, organisation and proliferation, supported by a possible gradient created by the controlled delivery of VEGF. This novel construct geometry opens interesting perspectives for pro-angiogenic therapies. Finally, we have explored the delivery of small hydrophobic therapeutics. The ultimate frontier in drug delivery is the cells cytoplasm and the different cellular organelles. The ability to reach this target allows the manipulation and control of cell fate, highly relevant on the context of stem cells. Retinoic acid (RA) is a hydrophobic molecule which has tremendous potential in cancer prevention and is a regulator of stem cells differentiation. RA acts upon nuclear receptors, therefore, the intracellular delivery is demanded for a successful application. We addressed this issue, by recurring to polyelectrolytebased nanoparticles, composed by polyethylenimine and dextran sulfate. The balance between the different components was shown to affect the RA loading capacity and the nanoparticles size. This system allowed the delivery of a significant amount of RA to the subventricular zone neuronal stem cells cytoplasm and differentiate this cells into the neuronal lineage more significantly than blank nanoparticles or by RA released outside the cells. We antecipate that such system could be delivered through the nasal cavity, straight to the brain, opening new perspectives on the treatment of neurodegenerative diseases.O conceito de libertação controlada de fármacos nasceu nos anos sessenta, o que seria traduzido rapidamente em produtos comerciais compostos por dispositivos com base em poli(etileno-co-vinil acetato). Desde essa altura, o campo evoluiu substancialmente. À medida que os conhecimentos de biologia celular, fisiologia e ciência dos materiais foram crescendo, abordagens mais eficazes foram sendo criadas. Hoje em dia, os dispositivos de libertação controlada de entidades terapêuticas ou mesmo células, atingiram a escala nanométrica. Estas abordagens apresentam elevada precisão biológica, o que nos levará, eventualmente, a uma medicina mais personalisada. Determinadas patologias são caracterizadas por vascularização deficiente, após o momento do insulto. Exemplos como o enfarte do miocárdio, feridas crónicas ou acidentes vasculares cerebrais tem um elevado peso na sociedade. A angiogénese terapêutica tem como objectivo a recuperação de tecidos lesionados com uma vascularização deficiente. Entre outras abordagens, o uso de factores de crescimento específicos, como o factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF), é uma das abordagens mais frequentes encontradas na literatura e abordada em ensaios clínicos. No entanto, os resultados em ensaios clínicos, utilizando apenas VEGF, não atingiu a eficácia terapêutica pretendida. Parte deste falhanço foi atribuído a uma entrega deficiente do factor bioactivo aos tecidos comprometidos, aliado ao tempo de semi-vida curto e à rápida filtração por parte do organismo. A cura de feridas cutâneas e doenças cardiovasculares são necessidades médicas que beneficiariam muito com estratégias eficientes de entrega e libertação de VEGF. Recentemente, o nosso grupo descreveu a síntese e caracterização de hidrogeis de dextrano oxidado (dexOx) (Maia et al. Synthesis and characterization of new injectable and degradable dextran-based hydrogels Polymer 2005;46:9604-9614). Este sistema foi usado como referência padrão e durante este estudo foi feito um esforço de realizar uma caracterização mais exaustiva de modo a melhorá-lo. Uma análise mais profunda do dextrano oxidado foi feita, focada na influência do grau de oxidação nas características microscópicas e macroscópicas do material. O grau de oxidação também foi estudado no contexto de um transporte eficiente de factores bioactivos, bem como na síntese de microgeis e hidrogeis após reticulação com ácido adípico dihidrazida. A questão de libertação de VEGF foi abordada, usando o dextrano oxidado como transportador. A reactividade natural do dextrano oxidado para N-nucleófilos torna este vector bastante apropriado para uma conjugação simples e directa, conferindo protecção e aumentando o tempo de semi-vida, por inibição do rápido consumo celular. O perfil de libertação do VEGF observado é bastante diferente de outros sistemas descritos na literatura. A libertação inicial pode ser moldada para ocorrer entre um a quarenta e cinco por cento da totalidade da proteína inicial. O VEGF é capaz de preservar a sua bioactividade, no entanto a conjugação ao dextrano oxidado, limita severamente a interacção com os receptores celulares e anticorpos específicos, retardando o seu consumo a nível celular. Hidrogéis de fibrina foram identificados, num outro trabalho, como sendo transportadores eficazes de células endoteliais. Foi mostrado que melhoravam a sobrevivência e proliferação dessas mesmas células. Nesse contexto, os hidrogéis de dexOx foram incorporados dentro dos hidrogéis de fibrina. A combinação de ambas as plataformas, numa matriz hibrída, suportou a adesão das células endoteliais e permitiu a sua migração, organização e proliferação, apoiada num possível gradiente criado pela libertação de VEGF do hidrogel de dexOx. Esta nova geometria abre perspectivas interessantes para novas terapias pro-angiogénicas. Por último, foi explorada a libertação controlada de agentes terapêuticos de baixo peso molecular e hidrofóbicos. A última fronteira em libertação de drogas é o ambiente citoplasmático e os diferentes organelos celulares. A capacidade de atingir este espaço permite a manipulação e controlo do destino celular, altamente relevante no contexto de células estaminais. O ácido retinóico é uma molécula hidrofóbica com um potencial tremendo na prevenção do cancro e como regulador da diferenciação de células estaminais. O ácido retinóico actua sobre receptores localizados no núcleo celular, nascendo a necessidade de entrega citoplasmática para uma aplicação bem sucedida. Este problema foi abordado, recorrendo a nanoparticulas baseadas em polielectrólitos (polietilenimina e dextrano sulfato). O balanço entre os diferentes componentes afecta a capacidade de transportar ácido retinóico bem como o tamanho final das nanopartículas. Este sistema permitiu a entrega de uma quantidade significativa de ácido retinóico no citoplasma de células estaminais neuronais da região subventricular promovendo a diferenciação em células da linhagem neuronal, ao contrário de nanopartículas vazias ou de ácido retinóico libertado fora das células. Antevemos que este sistema possa ser entregue ao cérebro através da cavidade nasal, surgindo como uma nova oportunidade no tratamento de diversas doenças neuro-degenerativas.Financial support provided by Instituto de Investigação Interdisciplinar III/BIO/20/200