Genética da população do Estado de São Paulo : análise de SNPs do cromossoma Y

Dissertação de mestrado em Medicina (Medicina Legal e Ciências Forenses) apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraUma vez que a diversidade do cromossoma Y se acumula nas linhagens masculinas, verificando-se uma especificidade populacional, os single nucleotide polymorphisms do cromossoma Y (Y-SNPs) permitem inferir sobre a origem de um indivíduo que possa, por exemplo, ter deixado uma amostra biológica numa cena crime. No entanto, no campo forense, mais do que um marcador de linhagem e informativo de ancestralidade, o seu estudo pode revelar-se indispensável quando as restantes metodologias já aplicadas na rotina parecem falhar ou revelar-se insuficientes e inconclusivas, designadamente em face da análise de amostras bastantes degradadas (i), no âmbito de investigações de parentesco complexas (ii) e na identificação de indivíduos em contextos de acidentes em massa (iii), podendo ter aplicação como método de exclusão simples e poderoso. Com a publicação da primeira árvore filogenética de haplogrupos binários do cromossoma Y, em 2002, foi possível a padronização da classificação de haplogrupo e da nomenclatura aplicada, o que permitiu que a troca internacional de conhecimentos e compreensão dos estudos publicados se tornasse uma realidade. Este foi um passo importante para que, em conjunto com o conhecimento das situações excepcionais de análise deste marcador — minimizando problemas de interpretação — e aumento das bases de dados populacionais, os Y-SNPs possam ocupar a posição de marcadores de excelência nos laboratórios forenses, actualmente detida pelos short tandem repeats do cromossoma Y (Y-STRs). Este estudo foi desenvolvido com o intuito de obter informações relativamente à possível origem biogeográfica da população de Ribeirão Preto (no Estado de São Paulo, Brasil) e consequentes relações filogenéticas. Historicamente, a origem do povoamento do Brasil situa-se precisamente no estado de São Paulo, em 1532, com a chegada dos portugueses. A variedade étnica que caracteriza a sua população tem um contexto histórico relacionado com a vinda de grupos africanos e posteriores vagas migratórias de espanhóis, italianos, alemães e japoneses. De acordo com os dados históricos da população, grau de polimorfismo dos marcadores e de acordo com a estratégia hierárquica da árvore de haplogrupos, 14 SNPs do cromossoma Y foram seleccionados e estudados, de modo a caracterizar a composição dos haplogrupos binários do cromossoma Y presentes na população. O DNA (ácido desoxirribonucleico) de 81 indivíduos, obtido a partir de amostras de sangue de homens não relacionados da população de Ribeirão Preto, no Estado de São Paulo (Brasil), foi extraído através do método de Chelex® 100. Para a caracterização dos haplogrupos do cromossoma Y desta população, 14 Y-SNPs foram seleccionados e estudados num sistema hierárquico de 2 multiplexes, de acordo com a estratégia de genotipagem sugerida por BRIÓN et al. (2004), e posteriormente estudados numa reacção de amplificação, seguida da reacção de purificação através de ExoSap-IT® (Usb®). A reacção de minisequenciação utilizando o SNaPshotTM multiplex kit (Applied Biosytems) foi seguida de uma purificação SAP (Roche). Os produtos da reacção foram detectados por electroforese capilar, utilizando os ABI PRISM® 310 e 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosytems), analisando-se posteriormente os resultados através dos programas informáticos da ABI PRISM® (Applied Biosytems) GeneScan® v3.1 e GeneMapper® ID, v3.2, respectivamente. Um padrão interno, GeneScanTM120 LIZ Size Standard, foi previamente adicionado e o tamanho dos fragmentos das amostras obtido por comparação, resultando a genotipagem da população em estudo. Os haplogrupos presentes foram identificados e as frequências determinadas por contagem. A nomenclatura dos haplogrupos atribuída está de acordo com os estudos do YCC (2002), JOBLING e TYLER-SMITH (2003) e KARAFET et al. (2008). Os resultados obtidos apresentam-se em concordância com os dados históricos e estudos anteriores com outros marcadores — que indicam a inserção desta população no grupo das populações europeias ―, uma vez que entre os mais de 11 haplogrupos identificados, 73% correspondem a haplogrupos característicos dos europeus como R1b1, J2 e I(xI2a2). Embora com numa proporção menor, também foram detectadas as contribuições africanas, asiáticas e de ameríndios, não tendo sido detectado nenhum haplogrupo em contradição com os resultados previamente esperados. Deste modo, os dados obtidos podem tornar-se numa ferramenta útil em estudos de evolução e investigações forenses, como também no estudo da origem étnica de um indivíduo, através da análise de apenas alguns loci de Y-SNPs específicos para esta população.Non-stopping progresses in Science have been offering Forensic Genetics access to numerous very different tools, allowing it to continue responding to challenges that are more and more demanding. In this context, forensic community has developed a growing interest in single nucleotide polymorphisms (SNP), located on non-recombining portions of the Y chromosome. Unique characteristics, such as simplicity (i), abundance (ii), exclusive paternal heritage pattern (iii), (near) inexistence of recombination (iv), low mutation rate (v), viability for analysis in multiplex systems and using technologies of quick data processing (vi), allow for unequalled applications. Since Y-chromosome’s diversity accumulates in male lineages, presenting a population specificity, single nucleotide polymorphisms of the Y chromosome (Y-SNPs) allow to infer about the origin of n individual that might, for example, have left a biological sample in a crime scene. Nevertheless, in the forensic field, they are more than lineage and ancestry informative markers. Their study may become essential, when other routine methodologies applied seem to fail or prove insufficient or inconclusive, namely when facing the analysis of very degraded samples (i), in complex parental relationship investigations (ii) and in mass disaster individual identification (iii), since it may be applied as a simple and powerful exclusion method. With the publication of the first phylogenetic tree of binary Y-chromosomal haplogroups, in 2002, the standardization of haplogroup classification and of the applied nomenclature became possible, allowing for the international exchange of knowledge, as well as the understanding of published studies. Together with the knowledge of this marker’s exceptional analysis situations – minimizing interpretation problems – and the growth of population data bases, this was a major step towards Y-SNPs becoming reference markers in forensic laboratories, a position that is presently held by short tandem repeats of the Y chromosome (Y-STRs). This study’s objective was to obtain information regarding the possible biogeographic origin of Ribeirão Preto’s population (in São Paulo State, Brasil) and consequent phylogenetic relationships. Historically, the origin of Brasil’s settlement is precisely the São Paulo State, in 1532, with the arrival of the Portuguese. The ethnic variety that characterises its population presents an historic context related with the arrival of African groups and later migratory waves of Spanish, Italian, German and Japanese. Based on the historical data of the population, the markers’ polymorphism level and hierarchy strategy of the haplogroups tree, 14 Y-chromosome SNPs were selected, in order to characterize the composition of the binary Y-chromosome haplogroups present in the population. DNA of 81 bloodstains from non-related men of Ribeirão Preto population, in São Paulo State (Brazil), was extracted, using the Chelex® 100 method. To characterize the Y-chromosome haplogroups of this population, 14 Y-SNPs were selected and studied in a hierarchical system of 2 multiplexes, according to the genotyping strategy suggested by Brión et al. (2004), and later studied in an amplification reaction, followed by the purification reaction with ExoSap-IT® (Usb). The minisequencing reaction performed with the SNaPshotTM multiplex kit (Applied Biosytems) was followed by a SAP (Roche) purification. The reaction products were detected by capillary electrophoresis, using ABI PRISM® 310 and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosytems) and the results were later analysed, using software ABI PRISM® (Applied Biosytems) GeneScan® v3.1 and GeneMapper® ID, v3.2, respectively. An internal pattern, GeneScanTM120 LIZ Size Standard, was previously added and the size of sample fragments was obtained by comparison, resulting in the genotyping of the population being studied. The haplogroups that were present were identified and frequencies were determined by counting. Haplogroup nomenclature is in agreement with the YCC (2002), Jobling and Tyler-Smith (2003) and Karafet et al. (2008) studies. The results obtained are in accordance with the historical data and previous studies carried out using other markers — which indicate the insertion of this population in the European population group ―, once, in more than 11 haplogroups identified, 73% correspond to haplogroups that are characteristic to European, such as R1b1, J2 and I(xI2a2). Although showing a minimal participation, African, Asian and Amerindian contributions were detected, but no haplogroup was detected, contradicting previously expected results. The results obtained may become a useful tool in evolutionary studies and forensic investigations, as well as in the study of the ethnic origin of an individual as well, through the analysis of only a few loci of Y-SNPs that are specific to this population