Caracterização clínica e bioquímica das doenças mitocondriais na criança: contribuição para o estudo epidemiológico na Região Centro de Portugal

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Medicina (Ciências Bioquímica - Bioquímica), apresentada à Fac. de Medicina da Universidade de CoimbraNeste trabalho analisou-se a clínica, o diagnóstico, o prognóstico e a epidemiologia das doenças da cadeia respiratória mitocondrial (doença mitocondrial) em crianças na Região Centro de Portugal, uma década após o início do diagnóstico sistemático destas doenças no Hospital Pediátrico de Coimbra, em colaboração com o Laboratório de Bioquímica Genética do Centro de Neurociências da Universidade de Coimbra. O principal objectivo foi retirar, da nossa e da experiência de outros grupos, os ensinamentos necessários a uma melhor orientação futura destes doentes. O objecto do estudo é o grupo das 200 crianças cuja suspeita de doença mitocondrial foi investigada com recurso à análise de amostras de músculo esquelético (193 casos), fígado (41) e/ou miocárdio (11), no período de 1997 a 2006 (10 anos). As manifestações clínicas tiveram início no primeiro ano de vida em 71% dos casos (no período neonatal em 35%). Em 153 crianças a apresentação foi neurológica e/ou muscular. Cento e setenta e cinco doentes evoluíram com clínica do sistema nervoso central, 44 dos quais com doença multissistémica. A gravidade clínica traduziu-se em elevada mortalidade (27%), em grande percentagem de casos com agravamento clínico (13%) e em investigação etiológica alargada na maior parte dos casos. Os doentes foram classificados segundo os critérios clínico-laboratoriais de Bernier para o diagnóstico de doença mitocondrial em quatro níveis de probabilidade diagnóstica: definida (95 casos), provável (77), possível (10) e improvável (18). O diagnóstico de doença mitocondrial foi baseado na presença de uma síndrome (18 casos, oito com síndrome de Leigh), de alterações do DNA mitocondrial e/ou nuclear (nove), de fibras musculares vermelhas rotas (dois) e sobretudo na identificação de défice enzimático major da cadeia respiratória (91). A estes critérios majores, associou-se uma grande diversidade de critérios minores clínicos, metabólicos, enzimáticos, histológicos e genéticos. Os défices enzimáticos dos complexos IV (89 doentes) e I (68) foram os mais frequentes, tal como tem sido referido em outras séries. Em 84 doentes (42%) não se obteve um diagnóstico etiológico. Setenta e oito crianças (39%) tiveram o diagnóstico de doença mitocondrial. Em 38 casos (19%) chegou-se a um outro diagnóstico etiológico, destacando-se o grupo das outras doenças metabólicas e o das infecções virais. Dezassete destas 38 crianças cumpriam critérios de doença mitocondrial definida, que foi considerada secundária. Confirmou-se a grande variabilidade e a não especificidade clínica das doenças mitocondriais na criança, através da semelhança entre os vários grupos de diagnóstico na nossa série. A incidência e prevalência destas patologias são estimadas quase sempre em estudos retrospectivos como este. Variam amplamente com a população em causa e o modo de selecção dos doentes, a extensão da investigação etiológica e os critérios de diagnóstico aplicados. A incidência de doença mitocondrial com manifestação clínica na primeira década de vida, na Região Centro, foi estimada em 1/6500 nado-vivos, valor elevado em comparação com outras séries pediátricas. Em 2006, a prevalência pontual destas doenças nesta Região era de 1/ 18500 habitantes com menos de 10 anos de idade, o que está de acordo com a sua elevada mortalidade na infância. A abordagem diagnóstica das doenças mitocondriais é complexa, não existindo uma prova simples que as confirme ou exclua. O aparente peso excessivo dos défices enzimáticos da cadeia respiratória no diagnóstico e a pobreza relativa de alterações histológicas nos nossos doentes levou à análise detalhada dos estudos mitocondriais realizados (quer os inespecíficos, como os níveis de lactato, quer os específicos como a actividade enzimática). Assim, reclassificou-se os doentes aplicando a escala de Nijmegen, após exclusão dos dados enzimáticos e moleculares. Muito mais casos atingiram deste modo um nível superior de probabilidade diagnóstica, o que atesta a validade dos argumentos da suspeita diagnóstica e corrobora os resultados do estudo enzimático neste grupo de crianças. O diagnóstico dos nossos doentes baseou-se na clínica e no estudo bioquímico da cadeia respiratória, como seria de esperar numa população pediátrica, em que a maioria dos casos se deve a alterações do DNA nuclear. Ao contrário da investigação do DNA mitocondrial, realizada amplamente nos nossos doentes com uma taxa de diagnóstico molecular muito baixa, o estudo do DNA nuclear, efectuado em poucos casos, foi frequentemente positivo. É necessário maior investimento nos estudos moleculares, uma vez que as alterações mitocondriais, tanto enzimáticas como morfológicas, são muitas vezes secundárias. Elaborou-se um fluxograma diagnóstico que correlaciona a clínica, as alterações enzimáticas da cadeia respiratória, os achados histológicos e as alterações patogénicas do DNA mitocondrial e nuclear. Com base nesta análise e nos recursos disponíveis, propõe-se uma escala diagnóstica, inspirada na de Nijmegen, a aplicar no Hospital Pediátrico. Esta baseia-se numa tabela de dupla entrada com os critérios clínico-laboratoriais gerais de Nijmegen e os resultados do estudo enzimático da cadeia respiratória (ambos escalonados em improvável, possível, provável e definido). A escala proposta é mais restritiva em termos de probabilidade de diagnóstico final de doença mitocondrial para o caso individual do que a utilizada neste trabalho, reforçando-se a importância da clínica e dos estudos bioquímicos e histológicos na orientação da investigação molecular, de acordo com o fluxograma diagnóstico referido. Conclui-se pela necessidade do reforço da colaboração entre os grupos que investigam estas doenças, no sentido de estabelecer critérios de diagnóstico, definição e classificação uniformes. Só definindo a sua prevalência e história natural é possível organizar adequadamente o apoio aos doentes e famílias.In this study a review of the clinical presentation, diagnosis, prognosis and epidemiological data of childhood mitochondrial respiratory chain disorders (mitocondrial disorders) in the Central Region of Portugal is presented. This analysis was carried out one decade after the introduction of this diagnosis in the Paediatric Hospital of Coimbra, in cooperation with the Laboratory of Biochemical Genetics at the Centre for Neurosciences and Cell Biology of the University of Coimbra. The main objective is to improve clinical evaluation and follow-up of patients, based on our experience and that of other groups. For this purpose, we reviewed the clinical files of all 200 children whose investigation for a mitochondrial disorder included the analysis of muscle (193 patients), liver (41) and/or myocardium (11) samples, over a period of 10 years (1997 to 2006). Thirty five percent of the patients presented the disorder in the neonatal period and 71% in the first year of life. At presentation, 153 children had neurologic and/or muscular symptoms. Throughout evolution, central nervous system dysfunction affected 175 children, frequently in the context of multisystemic involvement (44 patients). Clinical severity was revealed by the high mortality (27%) and disease progression (13%) rates and by the extended etiological investigation performed in most cases. Patients were classified, according to Bernier criteria for mitochondrial disease in children, in four diagnostic probability groups: definite (95 cases), probable (77) possible (10) and unlikely (18). Diagnostic classification was based on the identification of a known mitochondrial syndrome (18 patients, eight with Leigh syndrome), pathogenic mitochondrial DNA and/or nuclear DNA mutations (nine), ragged red fibres (two) and a major respiratory chain enzymatic defect (91). Other minor clinical, metabolic, enzymatic, histopathological and genetic criteria also contributed to the diagnosis of these patients. Respiratory chain enzymatic complexes IV (89 patients) and I (68) were the most frequently affected, as in other series. In 84 patients (42%), an etiological diagnosis was not achieved. A mitocondrial respiratory chain disorder was established in 78 children (39%). A different diagnosis was found in 38 cases, other metabolic disorders and viral infections being the most commonly identified. Seventeen of these patients fulfilled criteria for definite mitochondrial disease and were classified as secondary. We have corroborated the great clinical variability and non-specific features of mitochondrial diseases in children through the similarity among the diverse diagnostic groups in our series. Mitochondrial disease incidence and prevalence are usually estimated through retrospective studies like the present one. Figures vary a lot, depending on the population under study and patient selection, investigation thoroughness, and diagnostic criteria. Incidence of mitochondrial disease in children under 10 years of age in the Central Region of Portugal was 1/ 6500 newborns, which is high compared to other paediatric series. In 2006 the prevalence in this region was 1/ 18500 children under 10 years of age, which confirms the high mortality caused by these disorders in childhood. The diagnostic approach for mitochondrial disorders is complex, since there is no simple test to confirm or exclude them. The apparent over-representation of respiratory chain enzymatic deficits and the relative paucity of histological abnormalities in our patients led us to analyse the mitochondrial studies performed. The patients were reclassified using the Nijmegen scale, after exclusion of enzymatic and molecular genetic data. With this new classification (the clinical and laboratory Nijmegen general criteria), a higher level of diagnostic certainty was obtained, confirming the value of diagnostic suspicion and respiratory chain enzymatic evaluation in this group of children. The diagnosis in our patients was mostly based on the clinical and respiratory chain biochemical studies, as would be expected in a paediatric population, in whom most mitochondrial disorders are caused by mutations in the nuclear DNA. These were investigated in only a few patients in our series and frequently yielded positive findings. As expected, pathogenic mutations in mitochondrial DNA, although broadly investigated, were rarely found. Since mitochondrial abnormalities, both enzymatic and morphological, are frequently secondary to other disease states, it is crucial to carry out in depth molecular genetic studies. A diagnostic chart, which emphasises the correlation of clinical, histological and enzymatic data with pathogenic mitochondrial and nuclear abnormalities, is presented in this work. Taking into account the present study and our resources, a new diagnostic scale based on the Nijmegen group classification, to be used in our Hospital, is proposed. It consists of two groups of data (clinical, metabolic/ imaging and histopathology versus respiratory chain enzymatic activity), both classified as definite, probable, possible and unlikely. The combination of general and enzymatic criteria allows a final patient diagnosis to be made. This new classification, being more restrictive than the one we employed in the present study, strengthens the need to use the entire patient’s data to decide on the appropriate molecular genetic studies, according to the proposed diagnostic chart. We conclude that there is a great need to reinforce collaboration among the groups investigating mitocondrial disorders, in order to establish uniform diagnostic criteria, a definition and classification. Adequate support to patients and families will not be possible unless the prevalence and natural history of these disorders are well defined