Determinação de Tramadol e Amitriptilina em amostras de condutores no âmbito de um projecto de investigação europeu

Dissertação de mestrado em Medicina Legal e Ciências Forenses, apresentada à Fac. de Medicina da Universidade de CoimbraA amitriptilina é um antidepressivo tricíclico que actua a nível da recaptação de diferentes neurotransmissores ao nível das sinapses, incluindo a serotonina e noradrenalina, potenciando ou prolongando, assim, os seus efeitos. O tramadol é um analgésico opióide sintético de acção central, análogo à codeína, admitindo-se que actue por uma ligação frágil ao receptor opiáceo , modulando a percepção da dor, e/ou através da inibição da recaptação sináptica de noradrenalina e de serotonina, actuando sobre o mecanismo de transmissão da dor. Estes dois medicamentos são actualmente muito utilizados, podendo dar origem a alterações cognitivas e psicomotoras significativas quando associados com a condução rodoviária. Na lei portuguesa está prevista, através do Código da Estrada aprovado pelo Decreto de Lei nº 44/2005, de 23 de Fevereiro, a proibição da condução sob a influência de álcool ou de substâncias psicotrópicas. Já a fiscalização de condutores suspeitos de se encontrarem sob a influência de álcool e/ou de substâncias psicotrópicas, encontra-se descrita na Lei nº18/2007 de 17 de Maio. A detecção de substâncias ilícitas pode ser efectuada, não só após o consumo, mas também durante longos períodos que podem ultrapassar as 24 horas, ainda que a concentração máxima destas substâncias seja atingida, tal como no caso do álcool, no intervalo de meia hora a 2 horas (quando administradas por via oral; quando por via nasal, injectável ou fumada o pico de C é imediato). Actualmente, são várias as amostras biológicas utilizadas, quer em toxicologia clínica quer em toxicologia forense, com o objectivo de detectar e quantificar medicamentos. As matrizes mais utilizadas para a detecção deste tipo de substâncias são a saliva, o sangue, a urina, o suor e o cabelo. A saliva é, sem dúvida, a matriz que tem demonstrado maior interesse nos últimos anos graças, particularmente, às vantagens que demonstra em relação às outras matrizes, nomeadamente a nível da facilidade e rapidez de recolha e pelo facto de reflectir melhor a concentração dos medicamentos na sua forma livre e consequentemente, traduzir melhor a quantidade de fármaco biologicamente activo em determinado momento. A detecção, identificação e quantificação destes compostos em amostras de saliva pode ser desenvolvida por diferentes técnicas, tendo especial relevância as técnicas de cromatografia gasosa (GC) e, mais recentemente, as de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS). Na Parte I da presente dissertação, faz-se uma introdução geral do assunto, pretendendo-se que a mesma seja uma revisão da literatura relativamente à origem do tramadol e da amitriptilina, o seu mecanismo de acção, suas propriedades farmacodinâmicas e toxicocinética, sua prevalência e influência a nível da condução rodoviária e métodos analíticos para a sua determinação. Na Parte II, define-se como objectivo geral deste trabalho o desenvolvimento de um método analítico devidamente validado que permita proceder à determinação simultânea de tramadol e amitriptilina em amostras de saliva recolhidas a voluntários condutores no âmbito de um projecto europeu (DRUID), utilizando um sistema de cromatografia líquida de alta resolução (LC), acoplado a um detector de espectrometria de massa (MS), com ionização por electrospray. A Parte III divide-se em três capítulos e descreve, na sequência do atrás mencionado, os trabalhos experimentais realizados, a validação do método desenvolvido e sua aplicação a casos reais, constituindo, desta forma, a nossa contribuição pessoal para o esclarecimento do assunto em estudo. O método desenvolvido e validado, por LC-MS, para a detecção, identificação, confirmação e quantificação de tramadol e amitriptilina em saliva provou ser específico e sensível, com elevados valores de precisão e exactidão e muito bons limites de detecção e de quantificação tanto para o tramadol (de 0,84 e 2,54 ng/ml, respectivamente), como para a amitriptilina (1,37 e 4,16 ng/ml respectivamente). Este método poderá assim, ser uma excelente opção em alternativa à utilização da cromatografia gasosa com espectrometria de massa (GC-MS) já que permite quantificar, com exactidão e precisão, concentrações muito reduzidas de tramadol e de amitriptilina. Esta metodologia demonstrou ser pouco morosa, ultrapassando algumas desvantagens das metodologias por GC-MS. Acresce ainda que o método provou ser selectivo e sensível para um reduzido volume de amostra (500 l), o que constitui uma vantagem inequívoca para a realização de análises toxicológicas em saliva. Em conclusão, a metodologia aqui desenvolvida e validada permitirá a determinação, em simultâneo e com uma única metodologia cromatográfica, de tramadol e de amitriptilina em saliva. Como técnica de elevado potencial em toxicologia forense, poderá vir a ser aplicada no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P.Amitriptyline, a tricyclic antidepressive that has shown capacity to block the reuptake of various neurotransmitters, including serotonin and norepinephrine at the synaptic nerve ends, by this way potentiates and extends the duration of the effects of these neurotransmitters. Tramadol is a synthetic, centrally acting opioid analgesic, similar to codeine, exerting is function by a weak biding to -opioid receptor and weak inhibition of reuptake of norepinephrine and serotonin, acting on the pain transmission mechanism. These two drugs belong to the group of the most consumed drugs and both of them have the ability to produce cognitive and psychomotor effects, which could be dangerous to a safe driving performance. Driving under the influence of alcohol and/or psychotropic substances is punished by the Portuguese jurisdiction, by the document “Código da Estrada” approved on the Law nº 44/2005, from February 23rd. Regarding to the control of the impaired drivers there is a specific part of the legislation that describes how it should develop (Law nº 18/2007, from May 17th). The detection of illicit drugs and medicines can be done, not only just after the use, but also after long periods of time that can reach 24 hours, even if the maximum concentration of these substances is reached in the interval of half-hour to 2 hours. At present time, several biologic samples are being used to perform the detection and quantification of several drugs in clinic and forensic toxicology. The most used matrixes to perform these procedures are oral fluid (saliva), urine, sweat and hair. Recently, saliva has demonstrated several advantages over the other matrixes, especially in what refers to the collection method (easier and faster) and because it reflects more truthfully the free fraction of the drug that is biologically active at a certain time. The detection, identification and quantification of these compounds in saliva samples can be done by several different techniques, particularly by gas chromatography (GC) and, more recently, by liquid chromatography associated to mass spectrometry (LC-MS). In the Part I of this dissertation, is done a general introduction to the subject developed, revising the literature referent to the origin of tramadol and amitriptyline, as well as, to their pharmacology and their pharmacodynamic and pharmacokinetic properties. It as also been taken in consideration their prevalence and influence on driving performance. The Part II describes the global aim of this paper, which is the development of an analytical method, properly validated, for the simultaneous detection of tramadol and amitriptyline, in saliva samples collected from drivers, voluntarily, as part of the European project DRUID, using a high performance liquid chromatography system associated to a mass spectrometer, with electrospray ionization. The Part III is divided in three different chapters and describes the experimental trials developed, the method validation steps and it application to real samples. The developed and validated method by LC-MS, for detection, identification, confirmation and quantification of tramadol and amitriptyline in saliva, proved to be specific and sensible, with high levels of precision and accuracy and good LOD and LOQ values for tramadol (0,84 and 2,54 ng/ml, respectively) and for amitriptyline (1,37 and 4,16 ng/ml respectively). This method proved to be an excellent option to the existent GC-MS methods, once it is able to quantify, with precision and accuracy, very small amounts of tramadol and amitriptyline, in a short period of time, overcoming some of the disadvantages of the GC-MS techniques. In addition to these facts, the use of such a small amount of saliva (500 l) is of extreme relevance, once we are talking about toxicological analysis in saliva. With the developed and validated methodology, excellent results can be obtained to determine, simultaneously, these drugs using a single chromatographic methodology, and in saliva. This technique has great potential in forensic toxicology, and is already being applied in the Forensic Toxicology Laboratory of the Centre Delegation of the National Institute of Legal Medicine