Desenvolvimento de células da retina em cultura : receptores ionotrópicos do glutamato e neurossecreção

Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular) apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de CoimbraAs células da retina do embrião de pinto em cultura foram utilizadas neste estudo com o objectivo de caracterizar as alterações na actividade e na expressão de diferentes subunidades dos receptores ionotrópicos do glutamato durante o desenvolvimento. Estudámos também a importância que a activação dos receptores ionotrópicos do glutamato tem na libertação de aminoácidos neurotransmissores, em retinosferóides e usámos culturas de células da retina do embrião de pinto em monocamada, onde seguimos a expressão da subunidade GluR4 do receptor do tipo AMPA, durante o desenvolvimento, e a possível contribuição destes receptores para a entrada de Ca2+ nas células após a sua activação. Observamos que a expressão das subunidades dos receptores de NMDA e AMPA/cainato nestas culturas primárias mimetiza a expressão das mesmas subunidades na retina de pinto em desenvolvimento no embrião. Também determinamos as alterações no conteúdo total e a libertação de vários aminoácidos após a estimulação dos receptores ionotrópicos do glutamato, em células da retina cultivadas na forma de retinosferóides. Os resultados obtidos indicam que os aminoácidos poderão actuar como moléculas sinalizadoras durante o desenvolvimento, provavelmente estimulando o comprimento e a densidade das neurites, podendo ainda estar envolvidos na propagação de ondas eléctricas nas células da retina, mesmo para aquelas células que não possuem "gap-junctions" nos retinosferóides de pinto, durante o desenvolvimentoin vitro. Determinamos também se os receptores do tipo AMPA, em células de retina do embrião de pinto em culturas de monocamada, podem contribuir para uma entrada de Ca2+ nas células e se estes dados se relacionam com a com a expressão da subunidade GluR4 dos receptores AMPA. Os resultados obtidos mostraram que a localização de GluR4 se correlaciona muito bem com a entrada de Co2+, uma vez que a área celular mais marcada com Co2+ é a região perinuclear, que é também a região que marca duma forma mais intensa para GluR4, só mais tarde, e com um estímulo muito forte, as células reagem duma forma positiva.We used chick retinas and chick embryo retina cells cultured as retinospheroids to characterise the changes in the activity and expression of ionotropic glutamate receptor subunits during development. We also studied the influence of ionotropic glutamate receptor activation on the release of amino acid neurotransmitters in retinospheroids, and used chick retina cells cultured as monolayers to follow the expression of GluR4 a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA) receptor subunit during development and the possible contribution of AMPA receptors for Ca2+ entry in the cells upon activation. We found that the NMDA and AMPA/kainate receptor subunits expression in the primary cultures mimics their expression in the developing chick retina. We have also determined the total content and the release of various amino acids stimulated by glutamate ionotropic glutamate receptor agonists in retinospheroids. We found, that amino acids may act as signalling molecules during development, by stimulating the length and density of neurites, and that they may be involved in electric wave propagation in retina cells, during developmentin vitro The functionality of AMPA receptors in chick embryo retina cells during development in vitro, was determined by using Co2+ uptake, and these data were correlated with the expression of the AMPA receptor subunit GluR4. We showed that the localisation of GluR4 is well correlated with the Co2+ entry, since the most stained area of the cell with Co2+ is the perinuclear area, which is also the most labelled with GluR4 and only later on, and with strong stimuli, the cells became Co2+ positive at the neuritis