Pyruvate-Kinase Deficiency in the Portuguese Population - A Molecular and Population Study

Tese de doutoramento em Antropologia (Antropologia Biológica) apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO estudo molecular dos doentes de naturalidade Portuguesa com anemia hemolítica por deficiência de piruvato-quinase (PK; EC 2.7.1.40) permitiu identificar 8 mutações diferentes no gene PKLR. Seis mutações são descritas pela primeira vez: 3 mutações missense [1435C>T(479Arg>Cys), 1670G>C(557Gly>Ala) e 1706G>A(569Arg>Gln)]; 2 mutações de splicing [IVS8(+2)T>G e IVS10(+1)G>C]; e a substituição –72A>G na região promotora. Foram ainda encontradas duas mutações missense [1456C>T(486Arg>Trp) e 993C>A(331Asp>Glu)], previamente descritas. As mutações missense resultam na troca de aminoácidos em zonas conservadas da subunidade PK-R, reduzindo a eficiência catalítica da enzima. A mutação 1435C>T ocorre no último dinucleótido do exão 10 e deverá afectar também o processo de splicing. A mutação -72A>G ocorre na sequência GATA mais próxima do exão 1, na região promotora R do gene PKLR, e é responsável por uma diminuição drástica da síntese de mRNA. A mutação IVS8(+2)T>G anula o local de splicing 5’ do intrão 8 e, devido à activação de um local alternativo de splicing, leva à inserção dos primeiros 20 nucleótidos do intrão 8 no mRNA. A mutação IVS10(+1)G>C anula o local de splicing 5’ no intrão 10, e leva à não inclusão do exão 10 no mRNA. Foram estudados 5 polimorfismos do gene PKLR [-148C/ T, 1705A/C, 1738C/T, T10/19 e (ATT)n] nos doentes e em 2 amostras populacionais distintas da região Centro de Portugal e de S. Tomé e Príncipe. A associação das mutações com os haplótipos definidos pelos polimorfismos, sugere uma origem única para qualquer uma das mutações recorrentes identificadas. A análise dos marcadores polimórficos nas amostras populacionais de Portugal e de S. Tomé e Príncipe mostra que a população subsariana apresenta níveis mais elevados de heterozigotia, maior diversidade haplotípica e um desequilíbrio gamético menorWe have studied the PKLR gene in unrelated Portuguese patients with haemolytic anaemia associated with erythrocyte Pyruvate Kinase (PK; EC 2.7.1.40) deficiency. Eight different mutations were identified, six of them for the first time: three missense mutations [1435G>A(479Arg>Cys), 1670G>C(557Gly>Ala), 1706G>A(569Arg>Gln)], two 5’ splice site mutations [IVS8(+2)T>G and IVS10(+1)G>C] and the point mutation -72A>G on R-PK promoter. Two previously described missense mutations, 1456C>T(486Arg >Trp) and 993C>A(331Asp>Glu), were also found. All missense mutations cause aminoacids substitutions in conserved regions of the PK subunit, affecting the catalytic efficiency of the enzyme. The new mutation 1435C>T in the last dinucleotide of exon 10 probably also affects the normal splicing of intron 10. The new regulatory mutation -72A>G within the GATA-A element in the R-type promoter region severely decreases the PK mRNA synthesis. Mutation IVS8(+2)T>G leads to a 20 nucleotides longer spliced transcript, due to the abolishment of the 5’ donor splice site and the activation of a cryptic splice site in intron 8. The IVS10(+1)G>C mutation, abolishing the intron 10 donor splice site, leads to the skipping of exon 10 in the mRNA transcript. Five intragenic PKLR polymorphisms [-148C/T, 1705A/C, 1738C/T, T10/19 and (ATT)n] were studied in PK-deficient patients and in two normal population samples of Central Portugal and S. Tomé e Príncipe. The haplotype analysis with the PKLR mutations using these five polymorphic markers suggests a single origin for each of the recurrent mutations found in the Portuguese population. The analysis of the polymorphic PKLR markers in the two distinct population samples of Central Portugal and S. Tomé e Príncipe showed higher heterozygosity values in the sub-saharan population, together with the presence of more haplotypes and lower linkage disequilibrium