Molecular approaches to detect cyanobacteria and their microcystins producing genotypes in Billings and Guarapiranga reservoirs, São Paulo, Brazil

As florações de cianobactérias em reservatórios de águas utilizadas para consumo humano são freqüentes hoje em dia e normalmente são atribuídas à crescente eutrofização destas águas. Em anos recentes o aparecimento de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas tem preocupado bastante os responsáveis pelo monitoramento da qualidade das águas, uma vez que estas toxinas representam risco para a saúde pública. A detecção precoce da presença de linhagens tóxicas nesses reservatórios é essencial para que ações corretivas de controle das florações tenham sucesso. No presente trabalho, a diversidade de cianobactérias presentes em alguns locais das represas Billings e Guarapiranga foi avaliada utilizando a técnica de DGGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante) e/ou construções de mini-bibliotecas de amplicons do gene de rRNA 16S e da região do espaço intergênico da ficocianina (PC-IGS). A DGGE, utilizando os iniciadores CYA359F/CYA781R específicos para o gene de rRNA 16S de cianobactérias, mostraram que estes organismos estavam presentes nas onze amostras de água analisadas. Microcystis aeruginosa (94-97% de identidades), Geitlerinema (89% de identidade) e Synechococcus (89% de identidade) puderam ser identificadas. A mini-biblioteca construída com os amplicons de rRNA 16S obtidos usando os iniciadores 27F1/1494Rc produziu seqüências de outro grupo de bactéria (Actinobacteria), indicando a inespecificidade desses iniciadores. Entretanto, na mini-biblioteca construída com os amplicons de PC-IGS obtidos usando os iniciadores PCβF/PCαR, somente seqüências de cianobactérias foram geradas. Nessa mini-biblioteca foram identificadas várias linhagens de Microcystis aeruginosa (98-100% de identidades) e também de Anabaena (89% de identidade). Esses dois gêneros de cianobactérias conhecidos por produzirem microcistinas, foram detectados na amostra de água que continha alta concentração desta toxina (23,49 μg/L). Os oligonucleotídeos iniciadores OMETF/OMETR foram desenhados para amplificar uma região pequena e variável do domínio da N-metiltransferase do gene mcyA e foram testados em treze espécies de cianobactérias isoladas das represas Billings e Guarapiranga. Seqüências geradas por esses iniciadores foram isoladas, clonadas e sequenciadas com sucesso em duas espécies controle (M. aeruginosa NPJB1 e M. panniformis SPC702) e em dois isolados das represas (M. aeruginosa SPC777 e M. protocystis SPC697). A amplificação dessa região do mcyA a partir dos DNAs dos isolados de cianobactérias permitiu identificar linhagens do gênero Microcystis potencialmente produtoras da toxina microcistina. Essa técnica uma vez bem estabelecida para organismos isolados, poderá proporcionar base suficiente para uma melhor detecção de comunidades aquáticas de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistinas em ambientes naturais.Cyanobacterial blooms in water reservoirs used for human consumption are frequent nowadays and are usually attributed to the increasing water eutrophization. In recent years, the appearance of toxin-producing cyanobacterial strains has concerned managers of water quality since these toxins represent a public health risk. Early detection of the presence of toxic strains in these reservoirs is essential for the success of bloom control corrective actions. In the present work, cyanobacterial diversity was evaluated in several sites of Billings and Guarapiranga reservoirs using DGGE (denaturing gradient gel eletrophoresis) and/or mini-library constructions of both 16S rRNA gene and phycocyanin intergenic spacer (PC-IGS) region amplicons. The DGGE, using CYA359F/CYA781R primers, specific for cyanobacterial 16S rRNA gene, showed the presence of these organisms in the eleven water samples analyzed. Microcystis aeruginosa (identities of 94-97%), Geitlerinema (identity of 89%) and Synechococcus (identity of 89%) were identified. The mini-library constructed with 16S rRNA amplicons obtained using 27F1/1494Rc primers produced sequences of another group of bacteria (Actinobacteria), indicating the unespecificity of these primers. However, the mini-library constructed with PC-IGS amplicons obtained using PCβF/PCαR primers, generated cyanobacterial sequences only. In this mini-library several Microcystis aeruginosa strains (identities of 98-100%) and Anabaena (identity of 89%) were identified. These two cyanobacterial genera known to produce microcystins were detected in a water sample containing a high concentration of this toxin (23.49 g/L). The OMETF/OMETR primers were designed to amplify a small and variable region of the N-methyltransferase domain of mcyA gene and were tested in thirteen cyanobacterial strains isolated from Billings and Guarapiranga reservoirs. Sequences generated with these primers were successfully isolated, cloned and sequenced in two control species (M. aeruginosa NPJB1 and M. panniformis SPC702) and in two isolates from these reservoirs (M. aeruginosa SPC777 and M. protocystis SPC697). The amplification of this region of mcyA using cultured cyanobacteria DNAs allowed the identification of Microcystis strains with the potential to produce microcystin toxin. This technique, after it is well established for cultured organisms, will provide a basis for better detection of potential microcystin-producing cyanobacterial aquatic communities in natural environments