Études spectroscopiques du mécanisme d’action de peptides synthétiques à potentiel antimicrobien

Cette thèse porte sur l’élucidation du mode d’action de peptides synthétiques qui sont des analogues cationiques du peptide modèle 14-mère. À l’instar des peptides antimicrobiens naturels, ces peptides synthétiques induisent des perturbations membranaires et une meilleure connaissance de leur mode d’action s’avère un élément déterminant pour le design de nouveaux peptides synthétiques qui présenteront une activité antibactérienne maximale et une activité hémolytique moindre. Afin de mieux caractériser le rôle de certains déterminants moléculaires sur l’interaction membranaire, nous avons sélectionné deux catégories de peptides, soit des analogues qui ont une structure secondaire en hélice α et qui sont non sélectifs à l’égard des membranes mimétiques de bactérie et des analogues qui forment des feuillets β intermoléculaires et qui sont sélectifs à l’endroit des membranes mimétiques de bactérie. Les études réalisées ont fait intervenir plusieurs techniques spectroscopiques comme la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie RMN des solides et la spectroscopie de fluorescence. Tout d’abord, nous avons vérifié le rôle des interactions électrostatiques sur l’interaction membranaire, et ce, en effectuant une étude comparative entre des analogues cationiques et anioniques. Les résultats obtenus démontrent que les peptides anioniques et cationiques ont un impact similaire sur la dynamique des têtes polaires des phospholipides et l’ordre conformationnel des chaînes acyle. Cependant, les tests de relargage ont démontré que seuls les peptides cationiques formant des feuillets β intermoléculaires sont sélectifs alors que les homologues anioniques qui forment des feuillets β intermoléculaires sont inactifs en présence des membranes mimétiques de bactéries et de cellules eucaryotes. Ensuite, pour mieux comprendre le mode de perturbation membranaire des peptides cationiques qui sont non sélectifs et sélectifs, nous avons effectué des études par spectroscopie RMN des solides sur des échantillons de peptides reconstitués dans des bicouches lipidiques mécaniquement orientées entre des lamelles de verre ainsi que échantillons bicellaires. Les résultats ont démontré que les peptides sélectifs perturbaient davantage l’orientation des phospholipides zwitterioniques en comparaison avec les peptides non sélectifs. De plus, les simulations spectrales réalisées sur les spectres expérimentaux suggèrent que les peptides non sélectifs induisent la formation de pores ayant une géométrie toroïdale. En terminant, nous avons étudié la topologie membranaire et la localisation dans la membrane d’un peptide ayant une conformation en hélice α (R5R10) et d’un peptide formant des feuillets β intermoléculaires (R4R11). Les résultats obtenus par RMN de l’azote-15 indiquent que le peptide R5R10 est localisé au niveau de la surface membranaire avec une certaine hétérogénéité dans l’orientation. Cette conclusion est soutenue par des expériences réalisées par spectroscopie infrarouge en mode ATR. Des mesures de distances à partir de la technique REDOR entre les phospholipides et les peptides ont permis de constater que le peptide en hélice α est localisé à proximité du noyau phosphore alors que le peptide en feuillets β agrégés est localisé plus superficiellement au niveau de la surface membranaire. Cette différence de pénétration dans la région interfaciale pourrait expliquer la différence de sélectivité entre le peptide R5R10 (non sélectif) et R4R11 (sélectif). De plus, les tests de relargage de la calcéine ont démontré que les deux peptides induisent une contrainte de courbure positive à la membrane lipidique. Ainsi, l’alliance des résultats suggèrent que le mode de perturbation membranaire des peptides R5R10 et R4R11 est similaire au mécanisme modèle du type sinking-raft.This thesis is related to the determination of the mode of action of synthetic peptides that are cationic derivatives of the model 14-mer peptide. Similarly to the natural antimicrobial peptides, these synthetic peptides induce membrane perturbations and a better understanding of their mechanism of action is of primary importance to design new synthetic derivatives displaying higher antimicrobial and lower hemolytic activities. In order to characterize the role of certain molecular determinants on the membrane interactions, we have focused on two categories of peptides, namely peptides adopting an α-helical conformation which are non-selective towards bacterial mimetic membranes and peptides forming intermolecular β-sheet structures which are selective towards bacterial mimetic membranes. The experiments were carried out with several spectroscopic techniques such as infrared spectroscopy, solid-state NMR spectroscopy and fluorescence spectroscopy. First, we have studied the effect of electrostatic interactions on the membrane interactions by doing a comparative study between cationic and anionic analogs. The results show that both the anionic and the cationic derivatives have a similar impact on the dynamics of the phospholipid polar headgroups and on the conformational order of the acyl chains. However, dye-release experiments have shown that only the cationic derivatives forming intermolecular β-sheet structures are selective whereas their homologous β-sheet aggregated anionic peptides are inactive in the presence of both bacterial and eukaryotic mimetic membranes Then, to better understand the mode of membrane perturbation of non-selective and selective peptides, we have performed solid-state NMR experiments on peptides reconstituted in oriented samples of phospholipids. The results have shown that the selective peptides disrupt even more the orientation of zwitterionic phospholipids than the non selective peptides. In addition, the spectral simulations performed on experimental spectra suggest that the non-selective peptides induce the formation of pores having a toroidal geometry. To conclude, we have studied the membrane topology and the location into the membrane of the α-helical peptide R5R10 and the β-sheet aggregated peptide R4R11. The results obtained using ¹⁵N NMR indicate that the α-helical peptide is located on the membrane surface with a certain degree of heterogeneity. This conclusion is also supported by experiments performed using ATR spectroscopy. Distance measurements between phospholipids and peptides using the REDOR technique indicate that the α-helical peptide is near the phosphate nucleus of phospholipids whereas the β-sheet aggregated peptide is superficially located on the membrane surface. The difference of penetration into the interfacial region could explain the difference of selectivity between the R5R10 peptide (non selective) and the R4R11 peptide (selective). In addition, dye-release experiments have shown that both peptides induce a negative curvature strain to the membrane. Therefore, by taking into account all the results, it seems that the mechanism of action of these peptides is similar to the sinking-raft model mechanism.Prix: Tableau d’honneur de la FÉS