Untersuchungen zur Adhäsion von oralen Streptokokken an zahnärztliche Werkstoffe in Abhängigkeit von der Auswertmethodik in vitro

Ein wichtiges Forschungsthema in der Zahnmedizin befasst sich mit der Adhäsion von Mikroorganismen an Zahnersatzmaterialien. Dabei sind v.a. kariesverursachende Leitkeime (wie Streptococcus mutans) von Interesse. Einen wichtigen Ansatz stellt dabei die Entwicklung von Restaurationsmaterialien, die eine geringe Adhäsion von Bakterien gewährleisten, dar. Diese wird zumeist in Versuchen in vitro bestimmt. Für derartige Versuche in vitro sind effiziente und präzise Quantifizierungsmethoden von Bedeutung. Hierbei wird v.a. auf eine einfache und zeitsparende Anwendung sowie möglichst wenige anfallende Abfallprodukte geachtet. Eine sehr anerkannte Methode für Versuche in vitro stellen Fluoreszenzfarbstoffe dar, die ursprünglich für Viabilitätsuntersuchungen, wie z.B. von Bakterien in Kuhmilch, gedacht waren, sich aber auch als Methode zur Quantifizierung der in Biofilm organisierten Mikroorganismen in Mikrotiterplatten durchgesetzt haben. Von besonderer Bedeutung für die Quantifizierung von Bakterien sind Fluoreszenzfarbstoffe, die nur die lebenden Bakterien erfassen. Ein solcher, neuerer Farbstoff ist Cytox Violet®, dessen Eigenschaften im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollten. Cytox Violet® wurde in verschiedenen Versuchsaufbauten mit der im biologischen Labor der Poliklinik für zahnärztliche Prothetik der Universität Regensburg bereits etablierten konventionellen Resazurin-Reduktionsmethode verglichen. Als Bakterienstamm wurde Streptococcus mutans ausgewählt, da dieser nachgewiesenermaßen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Karies spielt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden hierfür zunächst die Farbstoffkonzentrationen für drei unterschiedliche Quantifizierungsmethoden ausgewählt. Die erste Quantifizierungsmethode stellt dabei die konventionelle Resazurin-Reduktionsmethode (Methode A) dar. Bei dieser Methode wird das Resazurin während der Simulation der Biofilmbildung inkubiert. Bei der zweiten Quantifizierungsmethode wurde Resazurin erst nach bereits stattgefundener Adhäsion des S. mutans inkubiert (Methode B). Für die dritte Quantifizierungsmethode wurde der Farbstoff Cytox Violet® verwendet (Methode C), der auch erst nach der Bakterienadhäsion zugegeben wurde. Die Versuche wurden mit verschiedenen Farbstoffkonzentrationen mit den Probematerialien Glas, Polyethylen und Palapress vario durchgeführt. Es wurde eine Farbstoffkonzentration von 15 µl Resazurin pro ml PBS bzw. Bakterienlösung und 20 µl Cytox Violet® pro 200 µl PBS ausgewählt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die drei Quantifizierungsmethoden mit der festgelegten Farbstoffkonzentration jeweils mit und ohne vorherige Pellikelbildung in einem semistatischen Versuchsaufbau untersucht. Die Probematerialien entsprachen denen des ersten Versuchsaufbaus. Bei diesem Versuchsaufbau wurde von den Prüfkörpern, bei denen jeweils die höchste und die niedrigste Fluoreszenzintensität gemessen wurde, eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme mit 1700-facher und 3800-facher Vergrößerung erstellt. Dies geschah, um eine optische Kontrolle der Bakterienanlagerung zu gewährleisten. Mit einem Computerprogramm wurde anhand dieser Bilder die mit Bakterien bedeckte Oberfläche in Prozent ermittelt. Die Ergebnisse der drei Quantifizierungsmethoden fielen im zweiten Teil sehr unterschiedlich aus. Während bei Methode A weder ein Einfluss des Materials, noch des Pellikels auf die relativen Fluoreszenzintensitäten festgestellt werden konnte, traf bei Methode B beides zu. Bei Methode C hatte das Material keinen Einfluss, dafür aber die Pellikelbildung. In den Vorversuchsreihen war Methode B am präzisesten und Methode C besaß eine bessere Reproduzierbarkeit als Methode A. Zudem konnte in den Vorversuchen eine Abhängigkeit der Ergebnisse von der Verwendungsart des Fluoreszenzfarbstoffes festgestellt werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die konventionelle Resazurin-Reduktionsmethode (Methode A) mit der Quantifizierungsmethode mittels Cytox Violet® (Methode C) in einer hydrodynamischen Fließkammer verglichen. Dies geschah jeweils mit und ohne Pellikelbildung aus einer Speichelersatzlösung. Für die Versuche unter dynamischen Bedingungen wurden die Probematerialien Zahnschmelz, Sinfony und Palapress vario ausgewählt. Auch hier wurde aus oben genanntem Grund von jedem Versuch unter dynamischen Bedingungen eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Prüfkörpers, mit dem das höchste und niedrigste relative Fluoreszenzsignal erzeugt wurde, mit 1700-facher und 3800-facher Vergrößerung erstellt. Sowohl bei Methode A als auch Methode C konnte ein Einfluss der Materialien auf die relativen Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Bei Methode C war außerdem ein Einfluss der Pellikelbildung auf die relativen Fluoreszenzintensitäten feststellbar. Sowohl bei den Versuchen unter dynamischen Bedingungen als auch bei den semistatischen Versuchsaufbauten wurden sehr unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Bei den Hauptversuchen war Methode C ohne vorherige Pellikelbildung genauer als Methode A, bei den Versuchen mit vorheriger Pellikelbildung war es umgekehrt