Zasp52 mediates Z-disc formation and myofibril assembly via interacting with Alp/Enigma family proteins, α-actinin and filamentous actin

In the striated muscle, the Z-disc forms the boundary of the sarcomere and contains multiple proteins essential for many aspects of muscle structure and function. At the Z-disc, actin filaments from adjacent sarcomeres are crosslinked by α-actinin, which directly interacts with Zasp PDZ domain proteins. The Zasp PDZ domain family includes the Alp/Enigma family, which is an emerging class of Z-disc-associated proteins, and mutations in many of the family members have been linked to muscle disorders in H. sapiens. Zasp52 is a major D. melanogaster Alp/Enigma family protein, containing a PDZ domain, a Zasp-like motif and four LIM domains. Zasp52 co-localizes with α-actinin to Z-discs, and participates in Z-disc formation. This thesis employs D. melanogaster as a model system to study the molecular mechanism of Zasp52-mediated myofibrillogenesis. We show that Zasp52 is an early marker for Z-disc assembly and plays a crucial role in stabilizing adult Z-disc structure. Two additional D. melanogaster Alp/Enigma family proteins Zasp66 and Zasp67 are also important for Z-disc maintenance and function with Zasp52 in myofibril assembly. We demonstrate that the Zasp52 PDZ domain is required for direct interaction with α-actinin, and the C-terminal extension of the PDZ domain is necessary to optimize α-actinin binding. Rescue assays of a novel Zasp52 allele confirm the importance of the PDZ domain for fulfilling Zasp52 function in myofibril assembly. We show by flight assays that a Zasp52 mutant suppresses the α-actinin mutant phenotype, indicating that Zasp52 genetically interacts with α-actinin. In addition to α-actinin, we demonstrate by in vitro biochemical assays that Zasp52 directly interacts with actin via the extended PDZ domain and ZM area. A co-sedimentation assay shows that Zasp52 directly binds filamentous actin, and by confocal microscopy we observe that Zasp52 contributes to F-actin bundling. In addition, we can show that Zasp52 dimerizes, which may contribute to actin bundling. Finally, we demonstrate the genetic interaction of Zasp52, as well as Zasp66, with actin during indirect flight muscle myofibril assembly. Taken together, we propose a model in which Zasp52 interacts with Alp/Enigma family proteins, α-actinin, and actin to organize sarcomere assembly.Dans le muscle strié, le disque Z délimite le sarcomère et contient une multitude de protéines essentielles tant à la fonction que la structure du muscle. Au niveau du disque Z, l'α-actinine lie les filaments d'actine de sarcomères adjacents via une interaction directe avec les domaines PDZ des protéines Zasp. La famille de domaines Zasp PDZ comprend la famille Alp/Enigma une classe émergente de protéines associées aux disques Z, et des mutations chez beaucoup de membres de cette famille de protéines sont liées à des troubles musculaires chez l'homme. Chez la D. melanogaster, Zasp52 est une protéine majeure de la famille Alp/Enigma, et elle contient un domaine PDZ, un motif de type Zasp et quatre domaines LIM. Zasp52 co-localise avec l'α-actinine sur les disques Z et participe à la formation des disques Z. Cette thèse utilise la D. melanogaster comme système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire du développement des myofibrilles médié par Zasp52. Nous montrons que Zasp52 est un marqueur précoce pour l'assemblage de disque Z et joue un rôle crucial dans la stabilisation de la structure du disque Z chez la mouche adulte. De concert avec Zasp52, deux autres protéines de la famille Alp/Enigma, Zasp66 et Zasp67, sont également importantes pour le maintient des disques Z et l'assemblage des myofibrilles. Nous démontrons que le domaine PDZ de Zasp52 est nécessaire pour permettre une interaction directe avec l'α-actinine, et l'extension C-terminale du domaine PDZ est nécessaire pour optimiser la liaison à l'α-actinine. L'importance du domaine PDZ pour la fonction Zasp52 dans l'assemblage de myofibrilles a été confirmée lors d'essai de sauvetage d'un nouvel allèle de Zasp52. Nous montrons par des essais en vol qu'un mutant Zasp52 supprime le phénotype mutant de l'α-actinine, ce qui indique que Zasp52 interagit génétiquement avec l'α-actinine. En plus de l'α-actinine, nous démontrons par des essais biochimiques in vitro que Zasp52 interagit directement avec l'actine via le domaine PDZ étendu et la zone ZM. Un essai de co-sédimentation montre que Zasp52 se lie directement à l'actine filamenteuse, et par microscopie confocale, nous observons que Zasp52 contribue au regroupement des filaments de F-actin. De plus, nous avons montré que Zasp52 forme un dimère, ce qui pourrait contribuer au regroupement des filaments d'actine. Enfin, nous démontrons une interaction génétique entre Zasp52 et Zasp66, avec l'actine lors de l'assemblage indirecte des myofibrilles des muscle de vol. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel Zasp52 interagit avec les protéines de la famille Alp/Enigma, l'α-actinine et l'actine pour organiser l'assemblage du sarcomère