Caractérisation des rôles biologiques de la protéine IKAP et du complexe Elongator

As the first step in the complex process of gene expression, the transcription of genes from DNA to RNA by RNA polymerase II is subject to a multiplicity of controls and is thereby the endpoint of multiple cell regulatory pathways. We focused here on the molecular and cellular functions of IKAP and by extension of Elongator complex, initially found associated with the hyperphosphorylated RNA polymerase II during the elongation stage of transcription. IKAP is required for the assembly of Elongator subunits into a functional complex. Elongator has a histone acetyltransferase (HAT) activity associated with one of its subunits, named hELP3. In agreement with a potential role in transcript elongation, Elongator is associated with nascent RNA emanating from the elongating RNA polymerase II along the transcribed region of several yeast genes and chromatin immunoprecipitation experiments have also demonstrated an association of Elongator with genes in human cells. Different mutations in the human IKBKAP gene, encoding IKAP/hELP1, cause familial dysautonomia, a severe neurodevelopmental disease with complex clinical characteristics. Affected individuals are born with the disease and abnormally low numbers of neurons in peripheral nervous ganglions. To gain insight into the role played by IKAP and the Elongator complex in the transcription of genes and concomitantly learn about the molecular defects underlying the FD, an RNA interference approach was used to deplete the IKAP protein in human cells. In yeast, disruption of ELP1 (yeast homolog of human IKAP) is known to destabilize the ELP3 catalytic subunit, which leads to loss of Elongator integrity. Our experiments performed in human cells revealed that the levels of hELP3 protein is also affected by IKAP depletion after RNAi. We took advantage of this cellular loss-of-function model to identify genes whose transcription requires IKAP, by microarray experiments. Among the identified candidates, several were previously described to be involved in cell motility, or actin cytoskeleton remodelling. Because cell motility is of crucial importance for the developing nervous system, and therefore of obvious relevance to FD, the potential role of IKAP in cell motility was characterized at the cellular level. Several cell motility/migration assays demonstrated that the IKAP depletion has functional consequences so that IKAP-depleted cells showed defects in migration. Particularly, the reduced cell motility of neuronal-derived cell lines may be highly relevant to the neurodevelopmental disorder that affects FD patients. Whether or not the defects in cell migration resulted of impaired transcriptional elongation of the IKAP-dependent genes was investigated by chromatin immuno-precipitation technique. These experiments indicated that IKAP depletion leads to a decreased histone H3 acetylation in the transcribed region of its target genes in the context of Elongator complex. These acetylation defects are correlated with a decrease of the RNA polymerase II recruitment through the transcribed region of target genes, whereas the recruitment on the promoter is mostly unaffected. These results indicate that Elongator affects transcript elongation in vivo, but not the recruitment of the RNA polymerase II to the promoter. These very specific effects of IKAP/hELP1 depletion on histone acetylation and RNA polymerase II density across target genes are consistent with a direct effect of Elongator on transcriptional elongation in vivo and point to a function for Elongator in histone acetylation during transcript elongation.La transcription des gènes de l’ADN en ARN est fondamentale pour l’expression des protéines et la capacité de nos cellules à s’adapter à leur environnement. Ce processus finement régulé est catalysé par un enzyme, l’ARN polymérase II, vers lequel convergent une multitude de voies de signalisation. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux fonctions moléculaires et cellulaires de la protéine IKAP et du complexe Elongator. IKAP est la protéine qui assemble les sous unités d’Elongator en un complexe fonctionnel. Le complexe Elongator est associé à l’ARN polymérase II hyper-phosphorylée pendant l’étape d’élongation de la transcription et possède une activité histone acétyltransferase associée à une de ses sous unités, appelée ELP3. Chez la levure, Elongator est recruté an niveau des ARNs naissants, qui émanent directement de l’ARN polymérase II au niveau de la région transcrite des gènes étudiés. De plus, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine ont mis en évidence la présence du complexe Elongator au niveau de plusieurs gènes humains. Différentes mutations au niveau du gène IKBKAP, codant pour la protéine IKAP, sont responsables de la dysautonomie familiale, une maladie génétique qui affecte le développement du système nerveux périphérique. En effet, les individus affectés présentent une diminution de la densité de neurones au niveau des ganglions nerveux périphériques. L’objectif de nos travaux est de comprendre davantage le rôle de la protéine IKAP et du complexe Elongator dans la transcription des gènes et ainsi, d’investiguer les mécanismes moléculaires responsables dans la physiopathologie de la dysautonomie familiale. Un modèle de perte de fonction pour la protéine IKAP a d’abord été généré par interférence d’ARN. Des travaux réalisés chez la levure indiquent que la protéine ELP1 (homologue de IKAP chez la levure) est essentielle pour la stabilité de la sous unité catalytique du complexe, la protéine ELP3. Les expériences réalisées sur notre modèle humain démontrent que le taux de la protéine ELP3 est également affecté par la déplétion d’IKAP causée par l’interférence d’ARN. Ce modèle de perte de fonction a été utilisé afin d’établir la liste des gènes dont l’expression est contrôlée par la protéine IKAP, par des expériences de microarrays. Parmi les candidats identifiés, plusieurs ont été décrits comme impliqués dans la migration cellulaire et le remodelage du cytosquelette d’actine. Le processus de migration des cellules est fondamental au cours du développement du système nerveux et par conséquent particulièrement relevant dans le contexte de la dysautonomie familiale. L’implication d’IKAP dans la migration cellulaire a été investigué par différents tests de fonction qui montrent que la diminution d’IKAP dans différentes lignées cellulaires entraîne une réduction significative de leur capacité migratoire. Ces résultats suggèrent que la diminution du nombre de neurones observée dans les ganglions périphériques des patients atteints de la dysautonomie familiale pourrait résulter d’une altération de leur capacité à migrer au cours du développement. Enfin, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine ont été menées en utilisant notre modèle afin de déterminer dans quelle mesure le déficit de migration observé en l’absence d’IKAP serait la conséquence d’un défaut de la fonction d’Elongator au niveau de l’élongation de la transcription des gènes. Les résultats nous ont montré que la diminution d’expression d’IKAP entraîne une réduction de l’acétylation des histones H3 dans la région transcrite de ses gènes cibles. De plus, ce déficit d’acétylation est directement corrélé avec un désengagement progressif de l’ARN polymérase II le long de la région transcrite de ces gènes. Par conséquent, ces résultats démontrent que le complexe Elongator affecte l’élongation des transcrits in vivo, mais pas le recrutement de l’ARN polymérase II au niveau du promoteur. Ces effets très spécifiques de l’absence d’IKAP sur l’acétylation des histones et l’engagement de la polymérase II dans la transcription des gènes cibles montrent qu’Elongator exerce un rôle direct au niveau de l’élongation de la transcription de ces gènes. De plus, ces résultats suggèrent que la fonction d’Elongator serait d’acétyler les histones au cours de l’élongation transcriptionnelle in vivo