The role of TGF alpha in the therapy of mesothelioma

Etat de l'art. Le Mésothéliome malin (MM) est un cancer de la plèvre causé principalement par l’inhalation des fibres d’amiante. L’impact réel de la chimiothérapie sur la survie des patients atteints du MM reste controversé. Nous avons émis l’hypothèse que l’absence de réponse à la chimiothérapie est due à l’expression inadéquate de certains gènes dans les cellules tumorales. Nous avons précédemment montré que les inhibiteurs d’histones désacétylases (tels que le valproate, VPA) augmente significativement l’efficacité des composés utilisés en chimiothérapie. Un essai clinique récent sur 45 patients atteints de MM a montré que le VPA en combinaison avec la doxorubicine augmente le taux de réponse et améliore la qualité de vie. Méthodes. En utilisant des microdamiers (Agilent), nous avons comparé le transcriptome de deux types de lignées cellulaires (M14K et H28). Des analyses bioinformatiques (Ingenuity) ont permis d’identifier des gènes candidats les plus relevants. L’expression du facteur de croissance alpha des tumeurs (TGFα) a été validée par RT-qPCR et ELISA. Le niveau d’expression de TGFα a été modulé négativement par l’interférence ARN et positivement par transfection d’un vecteur exprimant son ADN complémentaire (ADNc). La signalisation induite par TGFα a été réduite avec des inhibiteurs (gefitinib et erlotinib) de l’activité tyrosine kinase d’EGFR. L’apoptose a été déterminée en évaluant la fragmentation d’ADN, l’externalisation de la phosphatidylsérine et l’activité caspase. La chimiothérapie combinée a été étudiée dans deux modèles de souris (ZL34 dans SCID et AB12 dans Balb/c). Résultats. Afin d’étudier les mécanismes associés avec la réponse à la chimiothérapie, nous avons comparé deux types de lignées cellulaires (M14K et H28) caractérisées par une différence de sensitivité à la doxorubicine+VPA. Nous avons observé que le niveau d’expression basale de TGFα est plus important dans les cellules "résistantes" H28 comparativement aux cellules "sensibles" M14K. Pour évaluer la relevance fonctionnelle de TGFα, nous avons modulé son expression soit par interférence ARN, soit par transfection d’un vecteur d'ADNc. Nos données montrent que la diminution de l’expression de TGFα corrèle avec l’induction de l’apoptose. Inversement, l’inhibition de l’apoptose se produit lorsque TGFα a été surexprimé. Vu que TGFα est le ligand d’EGFR, nous avons testé l’effet d'inhibiteurs de kinases (gefitinib et erlotinib) en combinaison avec VPA+doxorubicine. Ces deux inhibiteurs provoquent l’apoptose induite par VPA+doxorubicine dans les cellules chimio-résistantes H28. Enfin, la nouvelle combinaison thérapeutique VPA+doxorubicine+erlotinib empêche la croissance tumorale chez la souris. Conclusions. Nos données démontrent que TGFα est impliqué dans la chimiorésistance à la combinaison VPA+ doxorubicine, un traitement de seconde ligne pour le MM. Bien qu’inefficaces seuls, les inhibiteurs de tyrosine kinase synergisent pour induire l'apoptose dans les cellules chimio-résistantes et prévenir la croissance tumorale dans des modèles murins.Background. Malignant mesothelioma (MM) is a cancer of the pleura caused mainly by the inhalation of asbestos fibers. The impact of chemotherapy on the outcome of patients with MM is still unclear. We hypothesized that unresponsiveness to chemotherapy is due to inadequate gene expression in tumor cells. We have previously shown that inhibitors of histones deacetylases (such as valproate, VPA) significantly increases the efficacy of compounds used in chemotherapy. A recent clinical trial on relapsing MM patients has shown that VPA in combination with doxorubicin improves response rates and quality of life. Methods. Using Agilent microarrays, we compared the transcriptome of two types of cell lines (M14K and H28). Bioinformatic analyzes (Ingenuity) identified the most relevant candidate genes. Expression of transforming growth factor-alpha (TGFα) was validated by RT-qPCR and ELISA. TGFα expression level was modulated negatively by RNA interference and positively by transfection of a cDNA vector. TGFα signaling was reduced with EGFR tyrosine kinase inhibitors gefitinib and erlotinib. Apoptosis was evaluated by different techniques assessing DNA fragmentation, phosphatidylserine externalization and caspase activity. Combination chemotherapy was investigated in two mouse models (ZL34 in SCID and AB12 in Balb/c). Results. To study the mechanisms associated with the response to chemotherapy, we compared two types of cell lines (M14K and H28) characterized by a difference in sensitivity to doxorubicin+VPA. We observed that the basal expression level of TGFα was higher in "resistant" H28 compared to "sensitive" M14K cells. To evaluate the functional relevance of TGFα, we modulated its expression either by RNA interference or by transfection of a cDNA vector. A decrease of TGFα expression correlated with induction of apoptosis. Inversely, an inhibition of apoptosis occurred when TGFα was over-expressed. As TGFα is the ligand of EGFR, we tested the effect of gefitinib and erlotinib in combination with VPA+doxorubicin. Both EGFR inhibitors increased apoptosis induced by VPA+doxorubicin in H28 chemoresistant cells. Finally, the VPA+doxorubicin+erlotinib regimen prevented tumor growth in mice. Conclusions. Our data demonstrates that TGFα is involved in the chemoresistance to VPA+doxorubicin, a second-line regimen for MM. Although inefficient alone, tyrosine kinase inhibitors synergize to induce apoptosis in chemoresistant cells and prevent tumor growth in mouse models