Anomalies cromosòmiques i apoptosi en l'espermatogènesi d'individus infèrtils

ANTECEDENTS: Alguns pacients infèrtils amb cariotip somàtic normal presenten alteracions en el procés de l'espermatogènesi i increments d'anomalies cromosòmiques numèriques en les cèl·lules germinals. S'ha proposat que les aneuploïdies activen els sistemes de control cel·lular i desencadenen en processos de mort cel·lular programada. OBJECTIUS: 1) Desenvolupar una metodologia seqüencial que permeti la detecció, l'aïllament i l'anàlisi citogenètica de cèl·lules testiculars apoptòtiques. 2) Avaluar la relació entre la presència d'anomalies cromosòmiques i la inducció de processos apoptòtics en cèl·lules germinals prereduccionals, postreduccionals, fases meiòtiques, espermatozoides i cèl·lules de Sertoli procedents de biòpsies testiculars d'individus infèrtils. 3) Analitzar la freqüència d'anomalies cromosòmiques observades en les diferents etapes de l'espermatogènesi i contrastar aquesta informació amb les característiques seminals, l'estudi meiòtic i l'anàlisi de FISH en espermatozoides a fi d'identificar pacients amb un comportament similar. MATERIAL I MÈTODES: Per assolir aquests objectius es van utilitzar 31 biòpsies testiculars de pacients que van consultar per problemes de fertilitat. A partir del protocol desenvolupat es va dur a terme l'anàlisi de les anomalies cromosòmiques numèriques i dels processos apoptòtics. Es va analitzar la constitució cromosòmica de les cèl·lules germinals (pre-reduccionals, figures meiòtiques, cèl·lules post-reduccionals i espermatozoides) i de cèl·lules de Sertoli presents en les poblacions cel·lulars viable, apoptòtica i no seleccionada. Es va comparar la freqüència poblacional d'anomalies cromosòmiques entre les diferents fraccions cel·lulars. Finalment, es va realitzar un anàlisi d'agrupació basant-nos en els resultats obtinguts per cada individu. RESULTATS: Els resultats obtinguts demostren que la metodologia d'anàlisi és eficient per detectar l'associació de processos apoptòtics i anomalies cromosòmiques en cèl·lules testiculars. L'anàlisi dels resultats ha posat de manifest una selecció de les anomalies cromosòmiques cap a les fraccions apoptòtiques en les cèl·lules germinals pre-reduccionals i en els espermatozoides. En les cèl·lules germinals post-reduccionals, cèl·lules en profase I i cèl·lules de Sertoli ambdós processos són independents. CONCLUSIONS: 1) La metodologia desenvolupada permet la detecció, l'aïllament i l'anàlisi citogenètica de cèl·lules apoptòtiques en les diferents fases de l'espermatogènesi i en les cèl·lules de Sertoli de biòpsies testiculars diagnòstiques. 2) Les aneuploïdies observades en cèl·lules prereduccionals s'originen per errors de segregació durant la proliferació mitòtica i són eficientment eliminades via apoptosi. 3) La població d'espermatòcits primaris en profase I és majoritàriament euploide i no s'observa una relació entre la presència d'aneuploïdies i els processos apoptòtics. 4) No s'ha trobat correlació entre la presència d'aneuploïdies i d'apoptosi a les cèl·lules de Sertoli. 5) El punt de control del SAC no és eficient, fet que es reflecteix en un increment d'aneuploïdies en cèl·lules postreduccionals. No s'ha observat correlació entre la presència d'aneuploïdies i processos apoptòtics en cèl·lules postreduccionals. Aquestes cèl·lules són eliminades per vies independents de processos apoptòtics. 6) S'ha observat una relació entre els processos apoptòtics i la presència d'anomalies cromosòmiques en els espermatozoides. 7) La població analitzada és molt heterogènia pel que fa als percentatges d'anomalies cromosòmiques i a les dades clíniques. La qual cosa no ha permès determinar característiques clíniques comunes en les agrupacions realitzades en funció dels percentatges d'anomalies cromosòmiques en els diferents etapes de l'espermatogènesi. Aquestes dades reflecteixen la diversitat citogenètica i fenotípica de les poblacions infèrtils.BACKGROUND: Some infertile patient with normal somatic karyotype displays spermatogenic disorders and increased rates of numerical chromosome abnormalities in germ cells. It has been proposed that aneuploidies triggers cell cycle checkpoints leading to apoptosis. OBJECTIVES: 1) To develop a methodology allowing the sequential detection, isolation and cytogenetic analysis of apoptotic testicular cells. 2) To assess the relationship between the presence of chromosomal abnormalities and induction of apoptotic processes in testicular cells (pre- and post- reductional germ cells, meiotic stages, spermatozoa and in Sertoli cells) from infertile individuals. 3) To analyze the frequency of chromosome abnormalities observed in the different stages of spermatogenesis and to compare these data with seminogram, meiotic studies and sperm FISH analysis in order to identify patients with a common pattern. MATHERIAL AND METHOD: Thirty-one diagnostic testicular biopsies from patients who had sought consultation for fertility problems have been provided for this study. By using the developed methodology, we have analyzed the presence of numerical chromosome abnormalities and apoptotic processes. In these samples analyzed we have evaluated the chromosome constitution of germ cells (pre- and post-reductional germ cells, meiotic figures and spermatozoa) and Sertoli cells in the three cell populations (apoptotic, viable and non-sorted). Therefore, taken together all patient data, we have analysed the differences between the percentages of chromosome abnormalities in the three populations of germ cells and Sertoli cells. Finally, based on the results obtained, a cluster analysis of patients was build. RESULTATS: The methodology is efficient to detect apoptotic processes and chromosomal abnormalities association in testicular cells. The analysis of the results has revealed a selection of aneuploid cells to the apoptotic fraction in pre-reductional germ cells and in spermatozoa. However, in Sertoli cells, meiotic figures and post-reductional germ cells no relationship between apoptosis and aneuploidy was observed. CONCLUSIONS: 1) The developed methodology allows the detection, isolation and cytogenetic analysis of apoptotic cells at different stages of spermatogenesis and in Sertoli cells from testicular biopsies. 2) Chromosome abnormalities observed in pre-reductional germ cells arise from mitotic segregation errors and are efficiently eliminated through apoptotic processes. 3) Primary spermatocytes are mostly euploid and no relationship between aneuploidies and apoptosis is observed. 4) Aneuploidy in Sertoli cells do not trigger cell death through apoptosis. 5) The aneuploidy level observed in post-meiotic germ cells demonstrates that the spindle assembly checkpoint (SAC) is not efficiently enough to eliminate aneuploid cells through apoptosis. No relationship between apoptosi and aneuploidy are observed in post-meiotic germ cells. These findings together with the observed reduction of aneuploid spermatozoa suggest that aneuploid post-meiotic germ cells are eliminated by apoptotic-independent cell death processes. 6) Aneuploid spermatozoa are depleted from the seminiferous tubules by apoptosis. 7) Our population is very heterogeneous and thus no similar clinical characteristics could be indentified in patients clusters according to the frequency of chromosome abnormalities at different stages of spermatogenesis. This is explained by the cytogenetic and phenotypic diversity of the infertile populations