Estrategias de cultivo para optimizar la maduración in vitro de ovocitos de terneras prepúberes

Descripció del recurs: el 01 setembre 2012El potencial de desarrollo de los embriones producidos in vitro es afectado negativamente por un lado, a defectos en las cualidades intrínsecas de los ovocitos y por el otro, a las condiciones del medio de maduración in vitro. Así, el éxito de la maduración in vitro depende de la integridad de los factores intrínsecos en la maduración y la vitalidad nuclear y citoplasmática de los ovocitos, también a la adecuada combinación de los componentes empleados en el medio de maduración. En este sentido, el objetivo de esta tesis consistió en analizar la influencia de distintos componentes añadidos durante la maduración in vitro sobre la calidad del ovocito y el potencial de desarrollo del embrión, con la finalidad de mejorar el rendimiento en la producción in vitro de embriones de terneras prepúberes. En el primer trabajo, se evaluó los efectos de la adición del complejo Insulina-Transferrina-Selenio y Ácido ascórbico al medio de maduración in vitro de ovocitos de ternera prepúberes, ya que tienen un papel muy importante frente al estrés oxidativo producido en condiciones in vitro. Los resultados demostraron una mejora del potencial de desarrollo de aquellos ovocitos que fueron madurados solamente las primeras 12 horas en presencia de ITS y Ácido Ascórbico y las 12 horas restantes en un medio convencional, donde además se reveló una relación positiva entre el incremento del nivel de expresión de la ciclina B1, la distribución de los gránulos corticales hacia la periferia y la mayor tasa de blastocistos. En el segundo trabajo se analizó si la adición de leptina en distintas concentraciones incrementaba la tasa de blastocistos, porcentaje de apoptosis de las células del cúmulus y el nivel de transcripción de genes involucrados con la apoptosis y la competencia del ovocito. Los resultados indicaron que la adición de la leptina en los medios de maduración in vitro no incrementó el potencial de desarrollo embrionario, ni disminuyó los niveles de apoptosis en las células del cúmulus, existiendo un incremento en los niveles de apoptosis a mayor dosis de leptina. Por otro lado, las distintas concentraciones de leptina durante la maduración in vitro ocasionaron un bloqueo en la transcripción del receptor de la leptina (LEPR). En el tercer trabajo se propuso analizar durante la maduración in vitro la inhibición de una cisteína proteasa lisosomal, utilizando E-64 que es un inhibidor de la Catepsina B. Los resultados demostraron que la inhibición de la Catepsina B no incrementó el potencial de desarrollo embrionario, ni la calidad del embrión, incrementó los niveles de apoptosis en las células del cúmulus y la expresión de la proteína Catepsina B. Finalmente, la diferentes concentraciones de E-64 durante la maduración in vitro no produjo un efecto inhibitorio de la Catepsina B, probablemente relacionados a una degradación por aumento del estrés y el efecto tóxico de las altas concentraciones. En conclusión, nuestros estudios indican que la adición de moléculas como la leptina o E-64 durante la maduración in vitro de ovocitos de ternera prepúberes no mejora su capacidad intrínseca para el desarrollo embrionario. En cambio, los resultados obtenidos indican que es posible incrementar el porcentaje de blastocistos obtenido mediante la adición del complejo Insulina-Transferrina-Selenio y ácido ascórbico al medio durante las 12 primeras horas de maduración.The development potential of embryos produced in vitro is adversely affected by one hand, defects in the intrinsic qualities of the oocyte and the other to the conditions of in vitro maturation medium. Thus, the success of in vitro maturation depends on the integrity and vitality of the intrinsic factors in the maturation nuclear and cytoplasmic of oocytes, also the right combination of components used in the maturation medium. In this sense, the objective of this thesis was to analyze the influence of different components added during in vitro maturation on oocyte quality and potential of embryo development, in order to improve performance in the in vitro production of embryos prepubertal calves. In the first study, we evaluated the effects of adding Insulin-Transferrin-Selenium and ascorbic acid in vitro maturation medium of oocytes from prepubertal calf, as they have an important role against oxidative stress in vitro. The results showed an improvement of the development potential of those oocytes that were matured only the first 12 hours in the presence of ITS and ascorbic acid and the remaining 12 hours in a conventional medium, where they also found a positive relationship between increased expression level of cyclin B1, the distribution of cortical granules to the periphery and the highest rate of blastocyst. In the second paper examined whether the addition of leptin at different concentrations increased the blastocyst rate, percentage of apoptotic cumulus cells and the level of transcription of genes involved with apoptosis and competence of the oocyte. The results indicated that the addition of leptin in vitro maturation media did not increase the potential of embryonic development, or decreased levels of apoptosis in cumulus cells, there an increase in levels of apoptosis at higher doses of leptin. On the other hand, different concentrations of leptin during maturation in vitro caused a blockage in the transcription of the leptin receptor (LEPR). In the third study was undertaken to analyze during maturation in vitro inhibition of a cysteine protease lysosomal using E-64 is an inhibitor of cathepsin B. The results showed that inhibition of cathepsin B did not increase the potential of embryonic development or embryo quality, increased levels of apoptosis in cumulus cells and the expression of cathepsin B protein. Finally, different concentrations of E-64 during in vitro maturation produced no inhibitory effect on cathepsin B, probably related to degradation by increased stress and the toxic effect of high concentrations. In conclusion, our studies indicate that the addition of molecules such as leptin or E-64 during in vitro maturation of oocytes from prepubertal calf does not improve its intrinsic ability to embryonic development. Instead, the results indicate that it is possible to increase the percentage of blastocysts obtained by adding the complex insulin-transferrin-selenium and ascorbic acid to the medium during the first 12 hours of maturation