Neuroinvasion in prions diseases: study of FDC - sympathetic nervous system neuroimmune interface

Prion diseases are neurodegenerative diseases affecting the central nervous system (CNS) wherein the PrPd disease-associated prion infectious agent is an abnormal isoform of PrPc host-encoded cellular prion protein. The process through which the prion infectious agent is transferred to the CNS, the neuroinvasion, is still unknown, but secondary lymphoid organs seem to play an important role in prion amplification prior the invasion of the associated peripheral nervous system (PNS). In particular, modifications of follicular dendritic cells (FDC) and sympathetic nervous system (SNS) of lymphoid organs could influence the speed of neuroinvasion, and thus the length of the disease incubation period. It was shown that the lack of mature FDC prevents the replication of the infectious agent in secondary lymphoid organs. Likewise, sympathectomy delays the onset of the disease, and enhances sympathetic innervation reduces the incubation period. In mice, the relative positioning of FDC and sympathetic neural fibres plays a role in the incubation period following scrapie inoculation. This study thus focuses on the neuroimmune interface between FDC and sympathetic neural fibres. First, the number of close interactions between FDC and sympathetic neural fibres of five mouse strains with the same Prnpa genotype was estimated to check if it could explain the different incubation period observed after inoculation of primary bovine spongiform encephalopathy (BSE) infected-brain. Then we checked if scrapie infection, by oral or intraperitoneal route, could influence this neuroimmune interface between FDC and sympathetic neural fibres within Peyer’s patches (PP) and spleen of the C57BL/6 mouse strain. In the first part of this work, co-localizations between FDC and sympathetic neural fibres were observed in vivo within germinal centers (GC) of mouse spleen. Among the five mouse strains exhibiting the same Prnpa genotype, three strains (RIII-1, RIII-2 and 129/Ola) showed an incubation period about 100 days shorter than those of C57BL and C57BL/6 mouse strains when inoculated with primary BSE. Moreover, amplification by FDC seems an obligatory process before subsequent neuroinvasion as an intracerebral inoculation doesn’t reduce the incubation period observed with an intraperitoneal inoculation. A meticulous analysis revealed that the density of close interactions between FDC and sympathetic neural fibres is not higher for the three mouse strains with a shorter incubation period. However, these three mouse strains with a shorter incubation period after primary BSE inoculation have a higher proportion of FDC networks with close interactions than the mouse strains with a longer incubation period. These results suggest that it is not the quantity of sympathetic neural fibres close to FDC, but rather the percentage of FDC with close sympathetic neural endings that could influence the incubation period of prions diseases. In the second part of this work, it came out that prion infection did not result in neuronal loss within the PNS like observed in the CNS, and also did not modify the FDC-SNS neuroimmune interface of secondary lymphoid organs where PrPd deposits are observed within germinal centers. For a single mouse strain orally infected with scrapie, neither FDC networks hypertrophy nor sympathetic neural fibres closer than 10 μm from a FDC network were observed within GC of PP. Moreover, in our conditions, the prion strain did not seem to alter the neuroimmune interface between FDC and SNS in PP that could explain the different incubation periods observed with the 139A and ME7 scrapie strains. To check if prion infection does not modify the FDC-SNS neuroimmune interface, close interactions between FDC and sympathetic neural fibres already shown in the spleen were analyzed in the same mouse strain intraperitoneally infected with the 139A scrapie strain. In that case as well, no differences were observed in FDC network hypertrophy, in the in vivo density of sympathetic neural fibres closer than 10 μm from a FDC network, or in the proportion of well innervated FDC networks, compared to control mice. An in vitro model of coculture of splenic FDC from the same C57BL/6 mouse strain with nerve cells from dorsal root ganglia (DRG) also yielded similar results. FDC isolated from scrapie 139A infected mice exhibited the same neuritogenic or neurotrophic effects than FDC isolated from control mice. During these experiments, it was also noted that young-adult or middle-age mice showed both the same mean density of close interactions between FDC and SNS. However, with age, even if the splenic volume occupied by FDC networks halved, the proportion of FDC networks with close interactions almost doubled. It would be very interesting to check this last parameter in old mice that show some delay in neuroinvasion of prion disease but also to evaluate if this percentage of well innervated FDC network contributes to the prion pathogenesis within the spleen. In conclusion, scrapie 139A and ME7 strains don’t modify FDC-SNS neuroimmune interface of secondary lymphoid organs, not allowing explaining the different incubation period observed with equivalent infectious doses. Moreover, following an oral inoculation of prion, neuroinvasion within PP would not involve direct contact between FDC and sympathetic nerves, but rather another process still to be determined or implying other nerve fibres and/or mobile cells such as macrophages or dendritic cells. However, in the spleen, the percentage of FDC networks with close sympathetic neural fibres – rather than the number of sympathetic neural fibres close to the FDC network – observed for a given age, species and Prnp genotype at the time of inoculation could play a role in the different incubation periods observed for the same prion strain. The cellular compounds involved in the specific FDC microenvironment still have to be determined for each cell implied in the neuroinvasion process.Les maladies à prions sont des maladies neurodégénératives du système nerveux central (SNC) où l’agent infectieux prion PrPd associé à la maladie est une isoforme anormale de la protéine prion cellulaire PrPc de l’hôte. Le processus par lequel l’agent infectieux prion est transféré au SNC, la neuroinvasion, est toujours inconnu à ce jour, mais les organes lymphoïdes secondaires semblent jouer un rôle important d’amplification du prion préalable à l’envahissement du système nerveux périphérique (SNP) associé. Plus particulièrement, des modifications au niveau des cellules folliculaires dendritiques (FDC) et du système nerveux sympathique (SNS) des organes lymphoïdes peuvent influencer la vitesse de neuroinvasion, et donc la durée des périodes d’incubation de la maladie. L’absence de FDC matures empêche la réplication de l’agent infectieux dans les organes lymphoïdes secondaires. De même, une sympathectomie retarde l’apparition de la maladie, et une hyper-innervation sympathique raccourcit la période d’incubation. Chez la souris, il a même été montré que la distance relative entre les FDC et les fibres nerveuses sympathiques jouait un rôle dans la période d’incubation suite à une inoculation par la tremblante. Dans ce travail, nous avons donc analysé principalement l’interface neuroimmune entre les FDC et les fibres nerveuses sympathiques. D’abord, nous avons voulu vérifier si le nombre d’interactions proches entre FDC et fibres nerveuses sympathiques chez cinq lignées de souris avec le même gène Prnpa pouvait être la cause des différentes périodes d’incubation observées lors d’une inoculation primaire à l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Ensuite, nous avons voulu savoir si l’infection par la tremblante, par voie orale ou intrapéritonéale, pouvait modifier cette interface neuroimmune entre les FDC et les fibres nerveuses sympathiques au niveau des plaques de Peyer et de la rate chez la lignée de souris C57BL/6. Lors de la première série d’expériences, des colocalisations entre les FDC et les fibres nerveuses sympathiques ont été mises en évidence in vivo dans les centres germinatifs (GC) de la rate de souris. Parmi cinq lignées de souris ayant un génotype Prnpa identique, trois lignées (RIII-1, RIII-2 et 129/Ola) ont montré une période d’incubation plus courte d’environ 100 jours que celle de deux autres (C57BL et C57BL/6) après une inoculation primaire de l’agent ESB. De plus, l’amplification par les FDC semble être obligatoire avant le processus de neuroinvasion ultérieure puisqu’une inoculation intracérébrale ne réduit pas la période d’incubation observée lors de l’inoculation intrapéritonéale. Une analyse détaillée a révélé que la densité d’interactions proches entre FDC et fibres nerveuses sympathiques n’est pas plus élevée pour les trois lignées de souris avec une plus courte période d’incubation. Par contre, ces trois lignées de souris à courte période d’incubation pour l’ESB primaire ont une proportion de réseaux FDC avec des interactions proches plus élevée que les lignées de souris avec une plus longue période d’incubation. Ces résultats suggèrent donc que ce n’est pas la quantité de fibres nerveuses sympathiques proches des FDC, mais plutôt le pourcentage de FDC avec des terminaisons nerveuses sympathiques proches qui pourrait influencer la période d’incubation des maladies à prions. De la deuxième série d’expériences, il ressort que l’infection prion ne provoque pas, dans nos conditions expérimentales, une perte neuronale du SNP comme observé dans le SNC, et surtout ne modifie pas l’interface neuroimmune FDC-SNS des organes lymphoïdes secondaires où des dépôts PrPd sont bien observés au niveau des centres germinatifs. En effet, pour une même lignée de souris infectées par voie orale par la tremblante, ni une hypertrophie des réseaux FDC, ni des fibres nerveuses sympathiques éloignées de moins de 10 μm d’un réseau FDC n’ont été observées au niveau des centres germinatifs des plaques de Peyer (PP). De plus, la souche prion ne semble pas induire une interface neuroimmune différente entre FDC et SNS au niveau des PP pouvant expliquer les différentes périodes d’incubation observées pour les souches tremblantes 139A et ME7. Afin de vérifier que l’infection prion ne modifie pas l’interface neuroimmune FDC-SNS, les interactions proches entre FDC et fibres nerveuses sympathiques déjà observées au niveau de la rate ont été analysées pour la même lignée de souris infectées par voie intrapéritonéale uniquement par la tremblante 139A. Dans ce cas aussi, aucune différence par rapport aux souris contrôles n’a été observée pour l’hypertrophie des réseaux FDC, la densité de fibres nerveuses sympathiques éloignées de moins de 10 μm d’un réseau FDC in vivo, ou la proportion de réseaux FDC bien innervés. Un modèle in vitro de co-culture de FDC isolés de rate de la même lignée de souris C57BL/6 avec des cellules nerveuses issues de ganglions de la racine dorsale (DRG) a également donné des résultats dans ce sens. Les FDC provenant de souris infectées par la tremblante 139A ont des effets neuritogène ou neurotrophique identiques à ceux des FDC de souris contrôles. De ces deux séries d’expériences, il ressort aussi que des souris jeunes ou adultes présentent la même densité moyenne de fibres nerveuses sympathiques proches par volume de FDC. Cependant, avec l’âge, même si le volume de rate occupé par les réseaux FDC a diminué d’environ de moitié, la proportion de réseaux FDC avec des fibres nerveuses proches a presque doublé. Il serait donc intéressant de vérifier ce dernier paramètre chez des souris âgées ayant montré un retard dans la neuroinvasion des maladies à prions et ainsi voir si cette proportion de FDC bien innervés participe effectivement à la pathogenèse du prion au niveau de la rate. En conclusion, les souches tremblantes 139A et ME7 ne semblent pas modifier pas l’interface neuroimmune FDC et SNS des organes lymphoïdes secondaires, ce paramètre ne peut dès lors pas expliquer les périodes d’incubation différentes observées pour des doses infectieuses équivalentes. De plus, suite à une inoculation orale de l’agent infectieux prion, la neuroinvasion au niveau des PP n’impliquerait pas des contacts directs entre les FDC et les nerfs sympathiques, mais plutôt un autre processus encore à découvrir et faisant intervenir par exemple d’autres types de fibres nerveuses et/ou des cellules mobiles telles que les macrophages ou les cellules dendritiques. Par contre, au niveau de la rate, la proportion de FDC avec des fibres nerveuses sympathiques proches - plutôt que le nombre de fibres nerveuses sympathiques à proximité des FDC - établie pour un âge, une espèce et un génotype Prnp donnés au moment de l’infection, pourrait jouer un rôle dans les différentes périodes d’incubation observées pour une même souche prion. Les composants cellulaires impliqués dans le microenvironnement spécifique des FDC doivent encore être déterminés pour chaque type cellulaire impliqué dans le processus de neuroinvasion."Pathways and Mechanisms in the Spread of PrPSc to the Central Nervous System (PrPSc-nEUROpathways)" contract No QLG3-CT-2002-8103