Bioinformatische Analyse eines proteomischen Datensatzes im Verlauf der Epileptogenese

Epilepsien gehören sowohl beim Menschen als auch bei den Haustieren (Hund und Katze) zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen. Neben genetischen Ursachen tritt ein Großteil der Epilepsieerkrankungen nach einem Gehirninsult, wie zum Beispiel einem Schädel-Hirn-Trauma, auf. Trotz umfassender Bemühungen steht aktuell noch keine wirksame Interventionsmöglichkeit zur Verfügung, um die Epilepsieentstehung (Epileptogenese) präventiv verhindern zu können. Weiterhin wurden bislang noch keine klinisch einsetzbaren Biomarker identifiziert, die eine Abschätzung des Epilepsierisikos nach einem Gehirninsult oder eine Prognose über die Krankheitsentwicklung ermöglichen. Der Hauptgrund hierfür liegt in einem noch nicht umfassenden Verständnis der molekularen Veränderungen und Prozesse während der Epileptogenese. Globale Ansätze, wie differentielle Proteomanalysen, könnten hierzu einen wichtigen Beitrag leisten. Deshalb wurde im Rahmen des vorliegenden Dissertationsvorhabens eine bioinformatische Analyse eines proteomischen Datensatzes durchgeführt. Für diesen Datensatz wurden zu drei Zeitpunkten (zwei Tage, zehn Tage und acht Wochen) nach Induktion eines Status epilepticus im Verlauf der Epileptogenese Proben des Hippocampus (HC) und des parahippocampalen Cortex (PHC) gewonnen und massenspektrometrisch untersucht. Die drei Zeitpunkte spiegeln die frühe Post-Insult-Phase, die Latenzphase und die chronische Phase wider. In einem ersten nicht-hypothesengestütztem Ansatz wurde für den Datensatz eine gewichtete Netzwerkanalyse durchgeführt. Das Ziel einer Netzwerkanalyse ist es, unvoreingenommen die Struktur eines Datensatzes auf Modularität zu untersuchen und durch Selektion relevanter Module eine Reduktion des Datensatzes zu erreichen. Für beide untersuchten Gehirnregionen konnten mehrere Module bestehend aus stark miteinander verknüpften Proteingruppen detektiert werden. Durch Anwendung von Regressionsanalysen konnten hieraus für den HC fünf und für den PHC sieben Epileptogenese assoziierte Module selektiert werden. Die funktionelle Annotation dieser Module wurde mittels einer Pathway-Enrichment-Analyse näher untersucht. Hierdurch konnten einzelne Module bestimmten molekularen Prozessen, wie zum Beispiel dem funktionellen Bereich der zellulären Plastizität oder des Zellmetabolismus, zugeordnet werden. Die zusätzlich durchgeführte Principal-Component-Analyse liefert Hinweise auf neue mögliche Biomarkerkandidaten zur frühen Risikoeinschätzung und zur Überprüfung des Therapieerfolges nach einem epileptogenen Gehirninsult. Insgesamt konnten durch die Netzwerkanalyse bereits im Kontext der Epileptogenese diskutierte pathways identifiziert werden. Dies trägt zur Validierung des proteomischen Datensatzes bei. Zusätzlich wurden biochemische Reaktionswege detektiert, für die bislang noch keine Beteiligung bei der Epilepsieentstehung beschrieben wurde. Diese Reaktionswege und deren zugeordnete Proteine könnten mögliche neue Zielstrukturen zur präventiven Intervention nach einem epileptogenen Gehirninsult darstellen. In einer zweiten hypothesengestützten Analyse wurde der Datensatz auf Regulation von pathways untersucht, die mit der extrazellulären Matrix und deren Interaktion mit anderen Zellen bzw. mit den funktionellen Bereichen Zellstress und Zelltod assoziiert sind. Hierzu wurden durch eine Pathway-Enrichment-Analyse entsprechende Reaktionswege bestimmt. Für den Schwerpunkt der extrazellulären Matrix konnten in allen Phasen der Epileptogenese regulierte pathways detektiert werden. Die Analyse der diesen Reaktionswegen zugeordneten Proteine ergab Hinweise auf eine ausgeprägte differentielle Expression von Proteinen, die verschiedene Aufgaben bei Umbauvorgängen in der extrazellulären Matrix wahrnehmen können. Ferner konnte mittels einer immunhistochemischen Färbung das differentielle Expressionsmuster des Proteins Fermitin family number 2 bestätigt werden. Für den Fokus Zellstress und Zelltod ergab die Auswertung der Pathway-Enrichment-Analyse eine starke Regulation Apoptose assoziierter Prozesse. Die Analyse der den selektierten Reaktionswegen zugeordneten Proteine lieferte Hinweise auf mögliche Zielstrukturen für neuroprotektive Therapieansätze. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum besseren Verständnis der molekularen und zellulären Veränderungen im Gehirn während der Epileptogenese bei. Weiterhin bieten die Ergebnisse der Netzwerkanalyse umfassende Informationen über Epileptogenese assoziierte Proteingruppen und deren zeitliche Regulationsmuster. Diese unvoreingenommene Auswertung könnte eine Basis für die Identifizierung und Validierung neuer Zielstrukturen zur Prävention der Epileptogenese liefern. Die funktionelle Relevanz der Resultate der fokussierten Datenanalyse sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.Epilepsies are among the most common neurological diseases in humans as well as in small companion animals (dogs and cats). Besides genetic causes, epilepsies are often acquired after brain insults like traumatic brain injuries. Despite intense research efforts, there is currently no effective intervention available to prevent the development of epilepsy (epileptogenesis). Furthermore, no clinically applicable biomarkers have been identified yet which allow an estimation of the epilepsy risk after a brain injury or a prognosis about the further development of the disease. The main reason for this is the still incomplete and limited knowledge about the cellular and molecular changes in the brain during epileptogenesis. Global approaches such as proteomic studies can help to gain a deeper understanding of the pathophysiological processes. Therefore, a bioinformatic analysis of a proteomic data set was carried out in this study. Samples of the hippocampus (HC) and the parahippocampal cortex (PHC) were collected and analysed by mass spectrometry at three time points (two days, ten days and eight weeks) after induction of a status epilepticus during the course of epileptogenesis. The three time points reflect the early post-insult phase, the latency phase, and the chronic phase. In a first unbiased approach this data set was subjected to a weighted network analysis. The aim of this analysis has been to investigate the modularity of the data set and to achieve a reduction of the data set by selecting relevant modules. We were able to detect modules containing highly connected proteins for both brain regions. By using different regression analyses, five epileptogenesis related modules for the HC and seven for the PHC were selected. The functional annotation of these modules was determined by pathway enrichment analysis. In this way, some modules could be assigned to specific molecular processes such as cellular plasticity or cell metabolism. The additionally performed principal component analysis suggests possible biomarker candidates, which could serve in early risk assessment and in the evaluation of therapeutic outcomes after an epileptogenic brain insult. Overall, the detection of several already known epileptogenesis related pathways validated the data set further. Additionally, some pathways were identified which were not described previously in the context of epilepsy development. These pathways and their associated proteins may serve as novel targets for preventive interventions after an epileptogenic brain insult. In a second hypothesis driven approach the dataset was examined for regulated pathways related to the extracellular matrix and its interaction with other cells or to cell stress and cell death. For this purpose, respective pathways were identifed by pathway enrichment analysis. We were able to detect pathways associated with the extracellular matrix in all phases of epileptogenesis. The analysis of the proteins assigned to these pathways revealed a pronounced differential expression of proteins, which serve several functions during the structural changes in the extracellular matrix following a brain insult. Furthermore, the differential expression pattern of the protein Fermitin family number 2 was confirmed by immunohistochemical staining. The pathway enrichment analysis also revealed a strong regulation of apoptosis related processes. The analysis of the respective proteins assigned to the selected pathways suggested several target candidates for neuroprotective approaches. In summary, this study offers further insights into the molecular and cellular changes taking place in the brain during the development of epilepsy. The findings of the network analysis provide comprehensive information about epileptogenesis-related protein groups and their temporal regulatory patterns. In addition, this unbiased approach may serve as a basis for the identification and validation of new target structures for the prevention of epileptogenesis. Future studies are needed to further evaluate the functional impact of the results of the hypothesis-driven analysis