Clonatge, caracterització i regulació transcripcional del gen SA murí : identificació de la proteïna i implicació de la mateixa en el metabolisme mitocondrial

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaAquest treball està centrat en l'estudi i caracterització del gen SA de ratolí. Inicialment, en el nostre laboratori, es va identificar com un gen regulat per andrògens d'expressió exclusivament renal. Analitzant la distribució tissular del gen SA s'ha observat que s'expressa en altres teixits com el fetge, l'estómac o el testicle. S'ha aprofundit en l'estudi de la regulació del gen SA per part de les hormones sexuals, andrògens i estrògens, en el ronyó i el fetge de ratolí, òrgans a on s'expressa de forma abundant, especialment al ronyó. S'ha clonat el gen SA de ratolí complert, determinant l'organització genòmica i els límits exò/intrò; s'han obtingut diferents transcrits resultat de la transcripció del gen, la diferència entre ells es troba en la regió 5' gràcies a les diverses combinacions que es donen entre els tres primers exons no codificants del gen. S'han clonat 2 Kb del promotor pròxim del gen SA. Diferents fragments d'aquesta regió s'han fusionat al gen reportador luciferasa i les construccions obtingudes s'han utilitzat per determinar l'activitat promotora, en assajos de transfecció transitòria. Aquests assajos han permés definir i posteriorment analitzar possibles elements reguladors presents en el promotor SA, implicats tant en l'expressió basal com en la resposta andrògenica del gen, en vaires línies cel·lulars renals i una línia cel·lular hepàtica. S'han produït anticossos policlonals contra pèptids sintètics específics de la proteïna SA que han permés idenficar-la en extractes proteics de ronyó de ratolí. S'ha comprovat que la seva regulació androgènica és paral·lela a la del corresponent mRNA. La SA s'ha identificat com una medium-chain acyl-CoA synthetase mitocondrial, en aquest treball hem demostrat la seva localització mitocondrial en una línia cel·lular renal, així com, la seva activitat enzimàtica en front a un substracte hidrocarbonat com l'àcid octanoic. L'elevada homologia a nivell de seqüència aminoacídica que presenta la SA amb altres enzims acil-CoA sintetasa ens ha permés identificar un domini d'unió a l'àcid gras en la proteïna molt conservat en tots aquests enzims. Mitjançant tècniques de mutagènesi hem observat que algun dels aminoàcids que formen aquest domini podrien ésser essencials en l'activitat enzimàtica de la SA. Donat que la proteïna SA participa en el metabolisme dels àcids grassos, en aquest treball hem estudiat la possible implicació dels receptor nuclears PPAR sobre l'expressió del gen SA, realitzant estudis in vitro a nivell d'activitat promotora en assajos de transfecció transitòria i, realitzant estudis in vivo amb ratolins mascle que s'han sotmés al tractament farmacològic d'agonistes específics per aquests receptors.This work is based in the study and characterization of the mouse SA gene. We had first identified the mouse SA gene on the basis of its strong androgenic regulation in mouse kidney. Analyzing the tissue distribution of the gene it has been observed that is expressed in other tissues like the liver, the stomach or the testicle. It has been study the regulation of the gene by sexual hormones, androgens and estrogens, in the kidney and the liver of mouse, organs where it are expressed of abundant form, specially in the kidney. The complete mouse gene has been cloned, determining the genomic organization and the exon/intron boundaries; they have been obtained different transcripts result from the transcription of the gene, the difference among them is in the region 5' thanks to the diverse combinations that occur between the three first untranslated exons of the gene. We have cloned 2 Kb of the SA gene promoter. Different fragments from this region have cloned to the reporter gene luciferasa vector and the obtained constructions have been used to determine the transcriptional activity, by transitory transfection. These tests have allowed to define and later to analyze some regulating elements in SA promoter, implied so much in the basal expression as in the androgenic regulation of the gene, in several kidney and liver cellular lines. Polyclonal antibodies raised against SA-specific peptides revealed it in mouse kidney extracts. The protein androgenic regulation is parallel that of the mRNA. The SA protein has been identified like a medium-chain acyl-CoA synthetase located in the mitochondria, in this work we have demonstrated its mitochondrial location in a renal cellular line, as well as, its enzymatic activity forehead to a hydrocarbon substratum like octanoic acid. The SA present elevated homology with other enzymes acyl-CoA synthetase has allowed us to identify a binding domain to fatty acid in the protein very conserved in all these enzymes. By means of mutagenic techniques we have observed that some of the amino acids that form this binding domain be able essential in the SA enzymatic activity. Since SA protein participates in the metabolism of fatty acids, in this work we have analised the possible implication of the PPAR's on the SA expression gene, having made studies in vitro of transcriptional activity by transitory transfection and, doing studies in vivo with mice male that have been put under the farmacologycal treatment of specific agonists for these PPAR's