Development and characterization of sulfide-oxidizing biofilms

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaEn el present treball s'han desenvolupat i caracteritzat biofilms per a la detoxificació d'efluents contaminats amb compostos reduïts de sofre. En primer lloc es va dissenyar un bioreactor basat en una columna il·luminada que aporta una gran i heterogènia superfície d'adhesió per als microorganismes, i en el qual no hi ha aportació externa d'oxigen. El sistema de control, basat en el potencial redox, permet mantenir constant la concentració residual de sulfur d'hidrogen en el rang micromolar, evitant la inhibició dels microorganismes i mantenint al mateix temps la qualitat de l'efluent generat. S'han realitzat tres experiments per tal de provar el sistema, el primer amb un cultiu pur de Chlorobium limicola, i després amb mostres naturals (sediment lacustre i tapet microbià) per tal d'aconseguir biofilms complexos. Els biofilms es desenvolupen ràpidament assolint-se una elevada biomassa en tots els casos. El comportament dinàmic del sistema és més lent que el dels sistemes de biomassa en suspensió, però alhora més estable a les pertorbacions. De fet, el sistema és capaç de mantenir l'oxidació de sulfurs i la qualitat de l'efluent generat fins i tot quan les condicions de llum incident o de concentració de sulfur d'hidrogen a l'entrada del sistema canvien. S'han caracteritzat els biofilms complexos amb eines clàssiques (microscopi i anàlisi de pigments) i també amb eines moleculars (biblioteques genètiques). En primer lloc, s'han avaluat diferents mètodes d'extracció d'ADN per tal de trobar el millor per a les nostres mostres. S'ha comparat l'eficiència d'extracció quantificant l'ADN obtingut, i la diversitat recuperada en cada mètode amb electroforesi en gels de gradient desnaturalitzant (DGGE). El mètode basat en un trencament mecànic amb microesferes de vidre seguit d'una lisi enzimàtica i una extracció amb fenol és el més apropiat per a l'extracció d'aquests biofilms. La caracterització del biofilms ha revelat una elevada diversitat microbiana tant a nivell filogenètic com fisiològic. Ambdós biofilms presenten una gran riquesa d'espècies així com un elevat grau de microdiversitat entre alguns grups. S'observen algunes diferències en els grups filogenètics predominants entre els dos biofilms. S'han recuperat membres relacionats amb les subclasses Alpha i Gamma del grup Proteobacteria, amb el grup Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides així com amb cloroplasts d'algues en ambdós biblioteques genètiques. A més, en el biofilm desenvolupat a partir del sediment lacustre, també s'han trobat membres de les subclasses Beta i Delta-Proteobacteria, del grup Cianobacteria i dels bacteris Gram-positius de baix contingut en G+C (Firmicutes). Per contra, la biblioteca realitzada amb el biofilm desenvolupat a partir del tapet microbià conté una elevada proporció de clons relacionats amb les Epsilon-Proteobacteria i amb els Chlorobi. Tot i que els membres trobats pertanyent a tots aquests grups filogenètics són diferents, representen els mateixos grups funcionals. El sulfhídric era oxidat anaeròbicament pels bacteris fototròfics del sofre i els bacteris vermells no del sofre, i aeròbicament pels bacteris quimiolititròfics del sofre utilitzant l'oxigen produït pels organismes fototròfics oxigènics. Altres microorganismes com els bacteris heterotròfics podrien contribuir al funcionament del sistema a través del reciclatge de la matèria orgànica. En conclusió, trobem una elevada diversitat tant a nivell funcional com taxonòmic en els biofilms desenvolupats. Diferents grups funcionals representats per diferent espècies (heterotròfiques, fotoautotròfiques i quimioautotròfiques) coexisteixen al sistema. A més, també trobem microdiversitat (similitud per sobre del nivell d'espècie en la seqüència del gen 16S ADNr). Aquesta elevada diversitat podria ser molt important per al funcionament a llarg termini del reactor.This works deals with the development and characterization of complex sulfide-oxidizing biofilms. A bioreactor for biofilm development has been designed. The system is based on a non-aerated illuminated packed-column, which provides a large surface for microbial attachment. The reactor operates as a sulfidostat and the control system allows to maintain a constant concentration of residual sulfide in the micromolar range thus avoiding inhibition of sulfide oxidizers due to excessive sulfide load and ensuring a constant quality in the effluent. The system was first tested with a pure culture of Chlorobium limicola and, later on, with natural samples (freshwater lake sediment and a microbial mat) in order to develop complex biofilms. Biofilms developed vigorously on the column surface and high biomass was achieved in all the experiments. The dynamic behavior of the system was slower than in stirred reactors but more stable in front of sudden environmental changes. The system was able to process highly polluted effluents and to maintain the quality of the output generated even when conditions of light irradiance and sulfide income were suddenly changed. The biofilms developed were characterized using both, traditional techniques (i.e. microscopy and pigment analysis) and a molecular approach, in particular cloning and sequencing. First, of all, several DNA extraction procedures were evaluated in order to select the most suitable method for performing the diversity analysis of our biofilms. We compared the extraction efficiency (i.e. amount of DNA recovered), as well as the genetic diversity recovered by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). A DNA extraction based on a mechanical step of bead-beating followed by enzymatic lysis and by phenol-chloroform extraction, was the most appropriate protocol for these biofilms. Microbial characterization revealed that, in both cases, highly diverse biofilms covering a wide range of phylogenetic and physiologic groups had developed. Both biofilms presented high species richness and a high degree of microdiversity within some species. Some differences were observed in the predominant phylogenetic groups present in each biofilm. We recovered members affiliated to the Alpha and Gamma subclass of the Proteobacteria, the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group as well as plastids signatures from green algae in both biofilm libraries. Moreover, in the biofilm developed from the freshwater sample, other clones belonged to the Beta- and Delta-Proteobacteria, the Cyanobacteria and the low G+C Gram-positive whereas we recovered clones belonging to the Epsilon-Proteobacteria and to the Chlorobi only from the marine biofilm. Although members belonging to these phylogenetic groups were different in each case, they represented the same functional groups. Sulfide was oxidized both anaerobically by phototrophic sulfur bacteria and by purple nonsulfur bacteria, and aerobically by colorless sulfur bacteria using the oxygen produced by oxygenic phototrophs, as the system was non-aerated. Other groups, such heterotrophic bacteria, can also contribute to the functioning of the system by recycling organic matter. In conclusion, we found high diversity at both functional and taxonomic level. Different functional groups represented by different species (heterotrophic, photoautotrophic and chemoautotrophic microorganisms) coexisted in the bioreactor. Moreover, some of the species also showed microdiversity (similarity in 16S rDNA sequences below the species level). Such attributes could be very important for the long-term functioning and versatility of the reactor