Mecanismo del daño mecánico letal por reoxigenación en miocitos cardíacos

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaLos miocitos cardíacos sometidos a hipoxia prolongada presentan un gran aumento en la concentración de Ca2+ citosólico. Durante la reoxigenación, la reactivación de la producción energética mitocondrial en presencia de Ca2+ citosólico elevado provoca una activación exagerada de la contractilidad celular que puede llegar a deformar irreversiblemente el citoesqueleto y romper la membrana celular. Este fenómeno, conocido como hipercontractura, es el responsable de la muerte celular que se produce en los primeros minutos de reoxigenación y da lugar al patrón histológico de necrosis en bandas de contracción, que constituye el 90% de la necrosis en los infartos post-reperfusión. Sin embargo, en el modelo de miocitos aislados, la hipercontractura no se acompaña de muerte celular y las células hipercontraídas conservan la integridad de su sarcolema y cierta competencia metabólica. Esta discrepancia podría deberse a la ausencia de sobrecarga osmótica en el modelo de miocitos aislados. Durante la reperfusión se produce un gradiente osmótico entre el interior de las células (por los catabolitos que se han acumulado durante la isquemia) y el espacio extracelular. Como consecuencia de este gradiente entra agua al interior de las células creando un aumento de la tensión sobre la membrana que puede llegar a romperla. En este estudio se ha investigado la contribución del edema sobre la viabilidad celular en miocitos aislados sometidos a anoxia simulada y reoxigenación hipoosmótica, el papel de la fragilidad estructural, su evolución temporal y los mecanismos responsables de la misma. Además, se ha estudiado la interacción celular como posible mecanismo adicional de daño, utilizando parejas de miocitos conectados y sometidos a técnicas de micromanipulación. Los resultados demuestran que la hipercontractura coopera con la sobrecarga osmótica en la rotura de la membrana en miocitos reoxigenados. En cambio, el edema y la hipercontractura no producen disrupción del sarcolema en miocitos que no han estado sometidos a un período previo de anoxia. Así pues, la sobrecarga mecánica impuesta por el edema y la hipercontractura producen la muerte celular por rotura del sarcolema en miocitos que han desarrollado fragilidad estructural secundaria a la deprivación energética. La fragilidad no se recupera durante los primeros 40min de reoxigenación. La preincubación de los miocitos con TMZ, un fármaco estabilizante de los lípidos de membrana, es capaz de aumentar la resistencia mecánica y mejorar la supervivencia de células reoxigenadas sometidas a estrés osmótico. Este efecto de la TMZ indica que la fragilidad osmótica de los miocitos reoxigenados está relacionada, al menos en parte, con un proceso de degradación lipídica del sarcolema durante la anoxia. Además, los fármacos donadores de NO y antioxidantes lipídicos son capaces de mejorar la viabilidad celular en miocitos sometidos a estrés osmótico. El mecanismo de acción de estos fármacos no se conoce, aunque parece ser independiente de la vía del GMPc, lo que es compatible con la hipótesis de que el incremento de la fragilidad observada durante la reoxigenación se debe en parte a la acción de los radicales libres del oxígeno. Finalmente, en parejas de miocitos unidos por discos intercalares intactos, la hipercontractura de un miocito es capaz de transmitirse a un miocito adyacente. La transmisión célula a célula de la hipercontractura se puede prevenir utilizando heptanol, un bloqueante de los gap junctions. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la interacción química a través de los gap junctions entre células adyacentes puede contribuir a la transmisión de la hipercontractura. En conclusión, los resultados de este estudio demuestran la existencia de diferentes mecanismos capaces de causar la muerte celular durante los primeros minutos de reperfusión, y abren la posibilidad de prevenirla mediante intervenciones farmacológicas aplicadas en el momento de la reinstauración del flujo coronario.Prolonged hypoxia induces cytosolic Ca2+ overload in cardiac myocytes. During reoxygenation, reactivation of mitochondrial ATP production in the presence of high cytosolic Ca2+ levels induces an exaggerated contractile activity that eventually leads to irreversible cytoskeleton as well as sarcolemmal disruption. This phenomenon, also known as hypercontracture, is the main mechanism of the cell death taking place in the first minutes of reoxygenation, and gives rise to the characteristic histological pattern of contraction band necrosis present in the 90% of the post-reperfused necrotic myocardium. Nevertheless, hypercontracture is not associated to cell death in isolated myocytes, and hypercontracted cells maintain their sarcolemmal integrity and metabolic competence. This discrepancy could be due to the lack of osmotic stress in the isolated myocyte model. During reperfusion, an important osmotic gradient develops between the cells (which contain many catabolites accumulated during the previous ischemic period) and the extracellular space. As a consequence, water goes into the cells causing an increase in the membrane tension that eventually could induce its disruption. This study has investigated the contribution of swelling on cell viability in isolated myocytes submitted to simulated anoxia and hypoosmotic reoxygenation, the role of structural fragility, its temporal progression and the mechanisms involved in it. Moreover, cell interaction has been analysed as a potential mechanism of cell injury, by means of pairs of connected myocytes subjected to micromanipulation techniques. The results demonstrate a cooperation between hypercontracture and osmotic swelling in inducing membrane rupture of reoxygenated myocytes. However, swelling and hypercontracture does not promote sarcolemmal disruption when myocytes have not been subjected to a previous anoxic period. Thus, mechanical stress secondary to cell swelling and hypercontracture induces sarcolemmal disruption and cell death in myocytes with previous structural fragility secondary to energy deprivation. Fragility is not recovered at least during the first 40min of reoxygenation. Preincubation of myocytes with TMZ, a drug with lipid membrane stabilizing properties, is associated to an increase in mechanical resistance and to a better cell survival during reoxygenation in the presence of osmotic stress. This effect suggests that osmotic fragility in reoxygenated myocytes is related, at least in part, with sarcolemmal lipid degradation during anoxia. Moreover, NO donors and lipid antioxidants improve cell viability in myocytes submitted to osmotic stress. The mechanism of action of these drugs is not known, though it seems to be independent of GMPc pathway. This is in agreement with the hypothesis of the role of oxygen free radicals in the induction of reoxygenation-induced fragility. In pairs of connected myocytes through intact intercalated disks, hypercontracture of one of the cells can be transmitted to the neighboring cell. This cell-to-cell transmission of hypercontracture can be inhibited by heptanol, a gap junction blocker. These results suggest that chemical interaction through gap junctions between adjacent cells may contribute to transmission of hypercontracture. In conclusion, the results of this study demonstrate for the first time the cooperation of several different mechanisms to induce cell death during the very first minutes of reperfusion. The identification of these mechanisms opens the possibility of developing novel therapeutical approaches addressed to reduce cell death in the early phase of coronary flow restoration