MIP-1ß (CCL4) : estudio de su regulación transcripcional y evaluación de las implicaciones del polimorfismo a nivel del locus B

Consultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaLas Quimiocinas constituyen un pequeño grupo de moléculas estructuralmente relacionadas, que se caracterizan por regular el tráfico de varios tipos de leucocitos en condiciones fisiológicas y patológicas. En general las quimiocinas se han clasificado en cuatro grupos, en función de los residuos de cisteína que se encuentran en el extremo N-terminal de la proteína madura. Los cuatro grupos son: Las CXC quimiocinas ó a-quimiocina, las CC quimiocinas ó b-quimiocinas, las C quimiocinas ó g-quimiocina y finalmente la CX3C quimiocina ó d-quimiocina. Dentro del grupo de las b-quimiocinas, se encuentran MIP-1a y MIP-1b, que se localizan en el cromosoma 17q 11.2. Las quimiocinas ejercen sus efectos biológicos, a través de la unión con sus receptores que se encuentran expresados en la superficie de diversos grupos leucocitarios. Se ha descrito la utilización de tres receptores para MIP-1b: CCR5, CCR8 y CCR9, siendo el CCR5 el que le otorga propiedades antivirales, ya que éste representa uno de los correceptores del VIH-1. Se ha descrito que MIP-1b ésta codificada por dos loci, el Locus A y el locus B; y que éste último define un polimorfismo en la quimiocina. Esta forma polimórfica se caracteriza por la deleción de 15 pb en el exón 3, que se origina a partir de un cambio de base (A260 - G), provocando que se sintetice una proteína con 5 aminoácidos menos. Para determinar la incidencia de este polimorfismo dentro de la población sana, se estudió la distribución alélica en 200 individuos sanos a través de la técnica de PCR-SSP, confirmadas posteriormente por las técnicas de PCR-SSO post-hibridación y secuenciación; revelando que la frecuencia del alelo canónico representa un 83,5%, mientras que la frecuencia del alelo polimórfico representa un 16,5%. Así mismo el estudio fue realizado en una población de pacientes con enfermedades tiroideas autoinmunes, pacientes diabéticos, pacientes con hepatitis C, observando que existe una correlación entre la frecuencia genómica y la frecuencia alélica de estos pacientes respecto a la población normal. Sin embargo, en los pacientes con VIH se observaron diferencias claras y estadísticamente significativas respecto a los individuos sanos. Para estudiar los niveles de expresión de MIP-1a y de MIP-1b, utilizamos un protocolo que, aprovechando pequeñas diferencias a nivel de la secuencia nucleotídica, combina RT-PCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente los niveles de ARNm de los loci codificantes para cada una de las dos quimiocinas. El aspecto más relevante de esta técnica, es el uso de un fragmento de ADN recombinante, que actúa de Estándar Interno, tanto para MIP-1a como para MIP-b, a la vez que contiene un lugar de restricción para MspI. De esta manera actúa como control de la amplificación y de la digestión. Esta metodología se aplicó para determinar las posibles diferencias que pudieran existir en los niveles de expresión de los loci A y B de MIP-1b, en la línea celular U-937 tras su estimulación con PMA, LPS e ionomicina, así como también entre individuos sanos y pacientes VIH+ (de diferentes genotipos) en PBMCs y linfocitos T CD8+, estimulados con PHA e IL-2. El estudio mostró que los loci A y B se regulan de manera diferente en las células U-937 y las cinéticas de expresión de mRNA son equivalentes en PBMCs y linfocitos T CD8 de pacientes VIH+ y en controles. En términos generales el locus B contribuye de manera minoritaria a la síntesis de mRNA de MIP-1b y la cinética de inducción del mRNA de los linfocitos T CD8, se ve retrasada en heterocigotos y homocigotos (bb). Por otro lado, los niveles de expresión del receptor CCR5 en linfocitos T CD4+ son diferentes a los que presentan los controles. Finalmente, podemos concluir que MIP-1b ejerce un efecto diferencial sobre sus células diana debido a las distintas iso- y alo-formas que presenta.The chemokines are a small group of structurally related molecules that regulate cell trafficking of various types of leukocytes in physiologic and pathologic conditions. In general the chemokines can be divided into four groups based on a structural cysteine motiff found near to the amino-terminus of the mature protein. The four groups are as follows: The CXC or a-chemokines, the CC or b-chemokines, the C or g-chemokine and finally the CX3C or d-chemokine. Into the b-chemokines groups, we found MIP-1a and MIP-1b chemokines, that are clustered at chromosome 17 q 11.2. The chemokines exert their biological functions trough binding to seven transmembrane-domain receptors wich are expressed on a variety of leukocyte populations. Three receptors has been described for MIP-1b: CCR5, CCR8 and CCR9, being CCR5 who give it antiviral properties, because it is one of the VIH-1 coreceptors. Human MIP-1b in encoded by two loci, locus A and locus B, and the last one define a polymorphism in this chemokine. This polymorfic form is characterized by a deletion of the first 15 bp in exon 3 and its caused by a mutation A260-G, origining a protein that lacks 5 amino acids. In order to determine the healthy population incidence of this polymorphism, we have studied their allelic distribution in 200 donors using the PCR-SSP technique, confirmed by PCR-SSO technique post-hibridization and sequentiation, showing that the frequency of the canonic form represent a 83,5% whereas a polymorphic form represent a 16,5%. On the other hand, this study was done in a population of thyroid autoimmune disseasse patients, diabetes patients and , hepatitis C patients showing that exist a correlation between genomic frequency and allelic frequency that these patienes with the healthy population. However, the VIH patients showed differences statistically significant respect to the healthy population. In the study of the level expression of MIP-1a and MIP-1b, we used a protocol that, taking advantage of small difference in nucleotide sequence, combines RT-PCR and restriction with MspI to allow the semiquantitative assessment of mRNAs from the two chemokines. The key feature of our approach is the introduction of an internal standard common to MIP-1a and MIP-1b wich is co-amplified and contains a MspI restriction site. This allow and easy control of the amplification and the efficiency of the restriction. This method was used to determine the possible difference in the level expression of the loci A and B of MIP-1b in the cellular line U-937 after its stimulation with PMA, LPS and Ionomicine, as well as between healthy populations and VIH patients (of different genotype) in stimulated PBMCs and lymphocytes TCD8 with PHA and IL-2. The study show that the loci A and B are regulated of different way in the cellular line U-937, and the mRNA cinetics expression are equivalents in VIH patients and healthy populations PBMCs and lymphocytes TCD8. In general terms, the locus B contribute in a minoritary way to the synthesis of the mRNA of MIP-1b and the induction cinetic of the mRNA of the lymphocytes TCD8 are deleted in heterozigous and homozigous (bb). On the other hand, the expression levels of CCR5 receptor in lymphocytes TCD4 are different to the controls. Finally, we can conclude that MIP-1b acts in a different way in a target cells due to a different iso- and alo-forms that it present