Relación entre heterogeneidad intragenómica y formación de aberraciones cromosómicas

Las aberraciones cromosómicas representan cambios citológicamente visibles que afectan al número o a la estructura de los cromosomas que constituyen el cariotipo de la especie. La asociación entre desórdenes genéticos y presencia de aberraciones cromosómicas las convierte en marcadores de riesgo, especialmente a las aberraciones de tipo estructural (ACs). Se considera que las aberraciones estructurales se generan a partir de roturas de doble cadena (DSBs) no reparadas o reparadas incorrectamente. Sin embargo, no se conocen los factores que pueden modular la formación de las ACs. En este sentido, la estructura y la organización del DNA en los organismos eucariotas generan diferentes niveles de condensación que podrían afectar la distribución de las ACs. Así, la organización de la cromatina relacionada con la actividad génica podría afectar la inducción y el procesamiento de las DSBs, como consecuencia de las posibles diferencias en accesibilidad entre las regiones activas e inactivas transcripcionalmente tanto a los agentes clastogénicos como a las enzimas de reparación. Por otra parte, la persistencia de las ACs es un requisito esencial sobre todo en los estudios retrospectivos o exposiciones crónicas. La estabilidad de las ACs se ha definido en función de su comportamiento durante el proceso de división celular. Sin embargo, ACs consideradas estables desde un punto de vista mitótico pueden también producir células desequilibradas si el cambio estructural afecta la expresión de uno o más genes esenciales para la supervivencia celular. Por lo tanto, la frecuencia y distribución de las ACs entre los cromosomas será el resultado de la inducción, procesamiento y persistencia del daño cromosómico. Teniendo en cuenta estas consideraciones, en esta Tesis doctoral se planteó evaluar in vivo e in vitro el efecto del tamaño y densidad génica de los cromosomas sobre la distribución y persistencia de las ACs, así como estudiar el efecto de la estructura de la cromatina en la inducción, procesamiento y persistencia del daño cromosómico. Para ello se analizó la distribución de las ACs bajo diferentes condiciones de exposición, utilizando diferentes marcadores y modelos celulares en función de los objetivos concretos. La distribución de las ACs se analizó utilizando la técnica de FISH. Así, en esta tesis doctoral se analizó la distribución de las ACs entre los cromosomas de mayor tamaño (cromosomas 1 y 4) y los de menor tamaño (cromosomas 18 y 19) que más difieren en densidad génica. Los estudios se realizaron in vitro después del tratamiento con un agente químico, como la bleomicina, o después de dosis altas de radiación ionizante y, in vivo después de dosis bajas de radiación ionizante. Los resultados obtenidos indican que la distribución de las ACs es proporcional al tamaño de los cromosomas estudiados independientemente de la densidad génica de éstos. Tampoco se detectaron diferencias entre los cromosomas al realizar el seguimiento de las ACs en el tiempo. Así, el tamaño y densidad génica de los cromosomas no afectan la distribución de las ACs ni la persistencia de las translocaciones. Por lo tanto, el tamaño y la densidad génica de los cromosomas no son factores a tener en cuenta a la hora de seleccionar los cromosomas a partir de los cuales estimar la frecuencia de ACs en estudios retrospectivos. Por otra parte, al utilizar un inhibidor de la reparación, como el ara-C, se detectaron diferencias intercromosómicas en la capacidad de reparación por escisión de las lesiones inducidas por la bleomicina. Además, de obtenerse resultados que indican la implicación de otras lesiones, además de las DSBs, en la formación de las ACs. La distribución y persistencia de las ACs se comparó también entre una región de heterocromatina constitutiva y una región de eucromatina. En este caso el estudio se realizó en células de hámster chino debido a que los cromosomas de hámster chino presentan grandes regiones de heterocromatina constitutiva. El análisis se realizó a nivel de los cromosomas sexuales tanto en interfase como en metafase utilizando FISH específica de brazo. El estudio en interfase se realizó mediante la técnica de condensación prematura de cromosomas (PCC) con el objetivo de analizar la inducción inicial y la dinámica de reparación durante las primeras horas después de la exposición. Los resultados indican que la estructura de la cromatina afecta a la inducción pero no al procesamiento de las DSBs. Por otra parte, la mayor frecuencia de intracambios respecto la de intercambios reflejó el efecto de proximidad en la interacción de las DSBs y el papel de la organización territorial de los cromosomas interfásicos en la formación de las ACs. En cuanto a la persistencia de las ACs, se observó una tendencia a una menor persistencia de las ACs que implican a regiones heterocromáticas. Para contrastar los resultados obtenidos en células de hámster chino, se comparó en células humanas la distribución de las ACs entre una región de heterocromatina constitutiva, la banda 1q12, y una región principalmente eucromática, la región 17cen-p53. En este caso, no se detectó el efecto de la estructura de la cromatina en la distribución de las ACs pero sí se detectó el efecto en la persistencia de las ACs. De hecho, la elevada inestabilidad de las translocaciones que afectan a la banda 1q12 puede tener implicaciones al utilizar las roturas en esta banda como un biomarcador de daño cromosómico en los estudios de biomonitorización. Por otra parte, la banda 1q12 presenta mayor capacidad fusigénica que otras regiones del genoma.Chromosome aberrations cytologically represent visible changes that affect the number or the structure of the chromosomes that constitute the karyotype of a species. The association between genetic disorders and the presence of chromosome aberrations makes them good risk markers, specially the structural type aberrations (CAs). It is considered that structural aberrations are generated from unrepaired, and/or incorrectly repaired, double strand breaks (DSBs), but the factors that can modulate the formation of the CAs are unknown. In this sense, the structure and the organisation of the DNA in eukaryotic organisms generate different levels of condensation that might affect the CAs distribution. Thus, the organisation of the chromatin related to gene activity could affect the induction and the processing of the DBSs which may be due to the possible differences in accessibility between the transcriptionally active and inactive regions. The persistence of CAs is an essential requirement in retrospective studies or chronic exposures. The definition of CAs stability has been based on their behaviour during the cellular division process. Nevertheless, CAs that are considered stable from a mitotic point of view can also produce unbalanced cells when the expression of one or more essential genes affects cell survival. Therefore, the frequency and distribution of the CAs between the chromosomes will be the result of the induction, the processing and the persistence of chromosome damage. In this PhD Thesis, the aim was to evaluate, both in vivo and in vitro, the effect of the size and gene density of the chromosomes on the distribution and persistence of the CAs, including a study of the effects of chromatin structure in the induction, processing and persistence of chromosomal damage. The distribution of the CAs was analysed using the FISH technique under different conditions of exposure by using different markers and cellular models based on the concrete objectives. Thus, in this PhD Thesis the distribution of CAs between the bigger chromosomes (chromosomes 1 and 4) and the smaller ones (chromosomes 19 and18) that have the most gene density difference was analysed. The studies were carried out in vitro after treatment with a chemical agent (bleomycin), or after high doses of ionizing radiation and, in vivo after low doses of ionizing radiation. The results indicate that the distribution of CAs is proportional to the size of the chromosomes independently of their gene density. Moreover, when the persistence of the CAs was analysed, no differences were detected. Thus, the size and gene density of the chromosomes do not affect the distribution of CAs or the persistence of the translocations, therefore, in retrospective studies these are not factors to consider when selecting chromosomes from which to consider the frequency of CAs. On the other hand, when using a repair inhibitor, such as ara-C, interchromosome differences in the capacity of excision repair were detected. In addition, the results indicate the implication of other lesions in the formation of the CAs apart from the DSBs. The distribution and persistence of the CAs were also compared in a region of constitutive heterochromatin and a region of euchromatin. In this case the study was performed using Chinese hamster cells because their chromosomes present large regions of constitutive heterochromatin. The analysis was carried out in the sex chromosomes both in interphase and metaphase by FISH, using chromosome arm-specific probes. The interphase study was performed using the PCC technique to analyse the initial induction and repair dynamics during the first hours after exposure. The results indicate that the structure of the chromatin affects the induction but not the processing of the DSBs. The higher frequency of intra- changes when compared to interchanges reflects the proximity effect in the interaction of DSBs and the role of the territorial organisation in the formation of the CAs. With regards to the persistence of CAs, there is a tendency towards less persistence when the heterochromatin regions are involved. In order to contrast the results from Chinese hamster cells with human cells, the distribution and persistence of the CAs was analysed in the constitutive heterochromatin band (1q12), and in a mainly euchromatic region (17cen-p53). In this case, there is no effect of the chromatin structure on the CAs distribution, whilst the effect on the persistence of CAs is detected. In fact, the high instability of the translocations involving the 1q12 band could lead to an underestimation of the damage when using the breaks in this band as biomarkers of chromosomal damage in biomonitorization studies. On the other hand, the 1q12 band presents greater fusigenic capacity than other regions of the genome