Generación y caracterización de modelos murinos transgénicos para el análisis de glutaminasas cerebrales

El estudio de modelos murinos transgénicos deficientes para un determinado gen (knockout, KO) es una de las principales herramientas que permite elucidar la función génica. Con el objetivo de modificar secuencias endógenas, se emplean técnicas denominadas de gene targeting, que explotan el principio de la recombinación homóloga para introducir secuencias exógenas dentro del genoma. Este proceso puede darse entre los llamados vectores de transgénesis, que portan secuencias modificadas de un gen, y las células embrionarias (ES) murinas. De esta forma se puedan introducir mutaciones puntuales que provoquen alteraciones en la expresión génica. Una de las técnicas más empleadas en gene targeting, utilizada en conjunción con la recombinación homóloga, es la recombinación lugar específica. Entre éstas, destaca el sistema Cre/loxP y el Flp/FRT, que consiste en secuencias específicas (loxP y FRT), que se sitúan flanqueando la región de interés, y que al actuar la recombinasa correspondiente, Cre o Flp, respectivamente, permiten escindir dicha región. La glutamina (Gln) es uno de los aminoácidos libres más abundantes en el cuerpo humano, con un gran número de funciones descritas, entre ellas, actúa como fuente de energía de las células en división y es precursor del neurotransmisor glutamato (Glu) y ácido γ-aminobutírico (GABA). La principal enzima encargada del catabolismo de la Gln es la glutaminasa (GA) que, activada por fosfato inorgánico, da lugar a Glu y amonio. En los mamíferos se han descrito dos genes que codifican para isoenzimas GA. En humanos, el gen GLS codifica para las isoformas KGA y GAC y el gen GLS2 lo hace para las isoformas GAB y LGA. Se han descrito genes ortólogos en rata y ratón, Gls y Gls2. En cuanto a la expresión de las isoformas GLS, KGA es ubicua en tejidos extrahepáticos; y GAC se expresa en músculo cardiaco, páncreas, placenta, riñón y pulmón. Las isoformas GLS2 (GAB y LGA) se expresan principalmente en hígado, cerebro, páncreas y sistema inmune. A nivel subcelular tanto KGA como las isoformas GLS2 presentan una localización mitocondrial, sin embargo, en cerebro también se ha descrito una localización nuclear para GLS2. Dado que el Glu no atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica debe ser sintetizado por las neuronas a partir de precursores locales, donde la GA desempeña un papel fundamental. Se ha descrito un ciclo Gln/Glu entre la neurona presináptica, postsináptica y astrocito, por el cual el exceso de Glu liberado a la hendidura sináptica es capturado por los astrocitos gliales, que mediante la glutamina sintetasa, se transforma a Gln. Esta Gln es liberada del astrocito y recapturada por las neuronas, donde vuelve a metabolizarse a Glu por la enzima GA. El hecho de que en cerebro se expresen cuatro isoenzimas diferentes, codificadas por dos genes distintos aún no ha sido explicado. No se conoce la contribución de cada una de estas isoenzimas al pool de Glu neurotransmisor, ni su posible papel en otra función que no sea la meramente catalítica. Para aclarar estos aspectos, en este trabajo decidimos generar un modelo animal transgénico deficiente en el gen Gls2 que nos permita arrojar luz sobre alguna de estas cuestiones, profundizando así en la función cerebral de las isoenzimas GA. El ácido lisofosfatídico (LPA) cumple una importante función como señal extracelular. Ejerce su acción a través de receptores acoplados a proteínas G, con un amplio abanico de respuestas, entre las que destacan la supervivencia, proliferación, migración y diferenciación celular. Hasta ahora se han identificado 6 receptores para el LPA, el primero de ellos, LPA1, tiene una expresión muy abundante durante el desarrollo cerebral. En este trabajo se ha caracterizado las sinapsis glutamatérgicas en un modelo KO-LPA1. Estos animales presentaban una morfología cortical alterada, con capas más finas y un patrón de distribución celular diferente al de animales silvestres; una neurogénesis reducida en la región del giro dentado; y una mayor actividad apoptótica. Mediante estudios comportamentales se observó que los ratones presentaban alteraciones en el desarrollo de la memoria contextual y alteraciones en la susceptibilidad a drogas. Como base molecular que subyace a las diferencias en la respuesta a drogas entre WT y KO-LPA1, se han descrito alteraciones en las vías glutamatérgicas del hipocampo dorsal. Con el fin de diseñar un modelo murino transgénico para el gen Gls2, se ha adquirido una construcción transgénica del consorcio IMPC para el silenciamiento condicional del gen. El vector de transgénesis sitúa los exones 2 a 7 entre los sitios loxP de reconocimiento por Cre recombinasa y rendirá animales KO nulos condicionales para las isoformas GLS2 en cerebro. Este vector de transgénesis ha sido incorporado en células madre embrionarias (ES) murinas por electroporación. Las células ES murinas mutantes fueron genotipadas para comprobar la recombinación homóloga. Se procedió a su microinyección en embriones en estadio de 8 blastómeras y se obtuvieron animales quiméricos heterocigóticos. La colonia heterocigota fue cruzada con animales que expresan la recombinasa Flp para eliminar la cassette Neo y secuencias de ayuste alternativo y poliadenilación, que conllevan a la terminación prematura de la transcripción y generación de una proteína truncada. Actualmente, se están cruzando entre sí para obtener los ratones homocigotos y posteriormente cruzarlos con animales que expresen la recombinasa Cre bajo un promotor específico de cerebro. Se ha caracterizado un modelo animal transgénico KO nulo total para el receptor LPA1. Estos animales presentan importantes déficits cognitivos y de memoria, si bien la base molecular de estas alteraciones no se ha caracterizado. Mediante una combinación de técnicas de biología molecular, inmunohistoquímicas y bioquímicas, hemos demostrado un dramático silenciamiento de la isoenzima KGA en corteza cerebral e hipocampo, y una drástica disminución en la actividad metaloproteinasa de matriz-9 en ambas regiones cerebrales. Los déficits de KGA y MMP-9 correlacionan con notables cambios morfológicos en las espinas dendríticas de neuronas glutamatérgicas piramidales del hipocampo de los animales KOLPA1, que presentan un fenotipo más inmaduro. Estas alteraciones en la morfología de las espinas afectan a la plasticidad sináptica y hacen prever la existencia de un menor número de conexiones sinápticas, lo que podría constituir la base molecular subyacente a las alteraciones en los procesos cognitivos que muestran estos animales