Antitumoral properties of epidermal growth factor derivatives

The members of the epidermal growth factor (EGF) / ErbB family are prime targets for cancer therapy. However, the therapeutic efficiency of the existing anti-ErbB agents is limited. Thus, identifying new molecules that inactivate the ErbB receptors through novel strategies is an important goal on cancer research. In this thesis work we have developed a shorter form of human EGF (EGFt) with a truncated C-terminal as a novel EGFR inhibitor. EGFt was designed based on the superimposition of the three-dimensional structures of EGF and the Potato Carboxypeptidase Inhibitor (PCI), an EGFR blocker previously described by our group. The peptide was produced in E. coli with a high yield of the correctly folded peptide. EGFt induced poor EGFR homodimerization and phosphorylation. Interestingly, EGFt promoted EGFR internalization and translocation to the cell nucleus although it did not stimulate the cell growth. In addition, EGFt competed with EGFR native ligands, inhibiting the proliferation of cancer cells. The lack of EGFR-mediated growth-stimulatory activity prompted us to evaluate EGFt for targeted delivery of 111In, an Auger electron emitter, into EGFR-positive cancer cells. An 111In-DTPA-EGFt radioconjugate was developed and its properties were analyzed and compared to those of 111In-DTPA-hEGF. First we determined that 111In-DTPA-EGFt displays high specificity and affinity for EGFR. However, the cellular uptake of 111In-DTPA-EGFt resulted to be lower than that of 111In-DTPA-hEGF. Once internalized, 111In-DTPA-EGFt showed a high efficiency to accumulate into the cell nucleus, where the radioactivity emitted by 111In may damage the DNA. In accordance, 111In-DTPA-EGFt showed to be cytotoxic in vitro against breast cancer cells, although its cytotoxicity was lower compared to 111In-DTPA-hEGF. In vivo studies revealed a longer half-life in blood for 111In-DTPA-EGFt than for 111In-DTPA-hEGF and higher uptake in the kidney, with minor accumulation in other normal tissues. 111In-DTPA-EGFt accumulated in MDA-MB-468 tumors where, interestingly, 111In-DTPA-EGFt was detected in a great proportion in the cell nucleus. All the data obtained from this work indicate that EGFt may be a potential EGFR blocker for cancer therapy and also an attractive ligand for delivery of cytotoxic agents into the nucleus of EGFR-positive cancer cells.Els receptors i lligands de la família del factor de creixement epidèrmic (EGF)/ErbB són dianes molt importants en el desenvolupament de teràpies contra el càncer. No obstant, l’eficàcia terapèutica dels fàrmacs dirigits a atacar aquesta via i que són utilitzats actualment en clínica és limitada. Per aquest motiu la recerca de noves molècules que inactivin els receptors d’aquesta família mitjançant noves estratègies és avui dia una de les vies més explorades. En aquesta tesi s’ha desenvolupat un pèptid idèntic al factor de creixement epidèrmic EGF que li manca la seva part C-terminal (EGFt) com a nou inhibidor de EGFR. El disseny d’aquest pèptid truncat s’ha basat en la superposició tridimensional de l’estructura de l’EGF i de l’inhibidor de la carboxipeptidasa de patata (PCI), un bloquejador de la via de l’EGFR descrit prèviament pel nostre grup. El pèptid ha estat produït en E.coli i s’ha aconseguit obtenir un alt rendiment de la proteïna i amb la seva conformació estructural correcta. Hem observat que l’EGFt in vitro té una capacitat molt menor per induir dímers del receptor i també la seva fosforilació si la comparem amb l’activitat que té l’hEGF natiu. Per altra banda, l’EGFt promou la internalització del receptor i la seva translocació al nucli cel·lular tal i com ho fa l’hEGF, tot i que no estimula el creixement cel·lular. A més, l’EGFt competeix amb els lligands natius de la família i inhibeix la proliferació cel·lular. La manca d’activitat estimuladora del creixement cel·lular d’aquest pèptid quan s’uneix a l’EGFR ens va portar a provar la utilització de l’EGFt com a vehicle de toxines dirigit a cèl·lules tumorals que sobreexpresessin EGFR. Concretament, es va produir un radioconjugat de EGFt amb l’isòtop radioactiu emissor d’electrons Auger Indi-111. Les propietats d’aquest radioconjugat es van analitzar i es van comparar amb el radioconjugat produït amb hEGF natiu. En primer lloc es va determinar que 111In-DTPA-EGFt té una alta especificitat i afinitat per EGFR. No obstant, la captació cel·lular de 111In-DTPA-EGFt va resultar ser menor que la de 111In-DTPA-hEGF. Un cop internalitzat, 111In-DTPA-EGFt va mostrar una alta eficiència per acumular-se en el nucli de la cèl·lula, on la radioactivitat emesa per 111In danya l'ADN. 111In-DTPA-EGFt va mostrar ser citotòxic in vitro contra cèl·lules de càncer de mama, encara que la seva citotoxicitat va ser menor en comparació amb 111In-DTPA-hEGF. Els estudis in vivo van revelar una vida mitjana més llarga en sang per 111In-DTPA-EGFt que per 111In-DTPA-hEGF, una major captació en el ronyó i una menor acumulació en altres teixits normals. 111In-DTPA-EGFt es va detectar en els tumors de cèl·lules MDA-MB-468 on el radiocompost es va acumular preferentment en el nucli de la cèl·lula. Les dades recollides en aquest treball indiquen que l’EGFt pot tenir un gran potencial com a bloquejador en teràpia pel càncer i a més pot ser un bon lligand per utilitzar com a vehicle d’agents citotòxics dirigits al nucli de cèl·lules tumorals positives en EGFR