Adaptación y modificaciones de corta y larga duración en la actividad eléctrica de neuronas de la corteza cerebral in vitro

El sistema nervioso central lleva a cabo sus complejas funciones gracias a la actividad armónica de sus unidades básicas, las neuronas, que son células de una enorme sofisticación morfológica y funcional. Una neurona típica recibe decenas de miles de aferencias y es capaz de generar en cada instante la respuesta bioquímica y electrofisiológica adecuada que permite la transmisión a otras células de una información coherente con el “status” funcional del sistema nervioso. Las aferencias que llegan al individuo son integradas mediante las relaciones sinápticas existentes entre las neuronas, que al contactar entre sí forman circuitos que constituyen verdaderas “redes” neuronales. La información aferente que recibe cada neurona es integrada generándose a su vez una información eferente que se transmite a las siguientes neuronas de los circuitos en los que está inmersa. La información eferente se codifica mediante la frecuencia de generación de potenciales de acción que se producen en el segmento inicial del axón y se propagan a lo largo de la fibra nerviosa. En el segmento inicial del axón se supone la existencia de canales de Na+ de umbral relativamente bajo, por lo que el valor del potencial de membrana en ese punto y la rapidez con que se modifique determinan la frecuencia instantánea de potenciales de acción, producidos por la activación asincrónica de conductancias dependientes de voltaje para el Na+ y el K+ (Hodgkin y Huxley, 1952). El desarrollo del conocimiento de la estructura del sistema nervioso mediante técnicas morfológicas, indujo un modelo de funcionamiento de cada neurona como un elemento pasivo, que realizaba la integración de la información mediante la suma de las aferencias que le llegaban, que en función de su disposición espacial y temporal determinaban el patrón de disparo neuronal. Posteriormente el estudio de las características electrofisiológicas de las neuronas modificó esta concepción de la actividad neuronal poniendo de manifiesto que conductancias dependientes de voltaje distinta a las descritas para el Na+ y el K+ en el axón del calamar (Hodgkin y Huxley, 1952), participaban en la modulación de la frecuencia de generación de los potenciales de acción, confiriendo así unas propiedades intrínsecas a cada neurona (Kandel, 1976; Llinás, 1988). Esta concepción de la actividad neuronal que se describió inicialmente en células nerviosas de invertebrados (Kandel, 1976), se pudo comprobar en neuronas del sistema nervioso central de vertebrados gracias a la utilización de la técnica de registro intracelular en secciones de cerebro, en las que era posible manipular el medio extracelular (Llinás y Sugimori, 1980a; Llinás y Jahnsen, 1982). El comportamiento electrofisiológico de las neuronas depende por tanto no solo del número, distribución y naturaleza de las entradas sinápticas (excitadoras e inhibidoras), sino también de sus propiedades intrínsecas que vendrán determinadas por los tipos de canales iónicos dependientes de voltaje que exprese en su membrana plasmática. El esquema general de la disposición de las conexiones sinápticas y los tipos de canales iónicos que una neurona presenta, vienen determinados genéticamente en orden a realizar las funciones que se han adquirido a través de la evolución filogénica. No obstante en este esquema se incluyen mecanismos que permiten realizar un ajuste fino a las condiciones externas de cada momento, dotando al sistema nervioso de una enorme plasticidad y por tanto posibilidad de adaptación a distintas situaciones, pudiendo discriminar la información aferente en rangos temporales de forma superior a cualquier otro sistema o adquirir estados funcionales distintos dependientes de situaciones previas. Como se ha señalado el estudio de las propiedades intrínsecas de las neuronas de vertebrados, avanzó de forma fundamental con el empleo de secciones de cerebro. En la década pasada se ha comprobado que neuronas agrupadas en áreas cerebrales concretas tienen, en general, idénticas propiedades eléctricas intrínsecas. El patrón de respuesta de las neuronas de la oliva inferior, por ejemplo, es característico (Llinás y Yarom, 1981)y se distinguen fácilmente de los patrones de disparo de neuronas del cerebelo, de la corteza cerebral o del tubérculo cuadrigémino superior (Llinás, 1988). El algunas estructuras, como por ejemplo el septum, diferentes tipos electrofisiológicos neuronales se disponen preferentemente en distintos subnúcleos y algunas células dependiendo del valor del potencial de membrana pueden presentar tipos de respuestas funcionales distintas (Álvarez de Toledo y López-Barneo, 1988; Steriade y Llinás, 1988). Parece existir por tanto, un “lenguaje electrofisiológico” típico de cada estructural cerebral que es el resultado de la individualidad biofísica de las neuronas. En la corteza cerebral la estructuración funcional se realiza mediante columnas perpendiculares a la superficie cerebral de unos 200-500 μm de diámetro (Mountcadtle, 1957; Hubel y Wiesel, 1977) que a su vez se dividen en capas atendiendo a las características morfológicas celulares. En el neocortex de mamíferos las neuronas se han clasificado atendiendo a sus propiedades electrofisiológicas intrínsecas (McCormick, Connors, Lighthall y Prince, 1985; Connors y Gutnick, 1990) en “células de disparo rápido”, que pueden mantener una alta frecuencia de disparo con poca o ninguna adaptación; “células de disparo regular”, que presentan una clara adaptación durante un pulso mantenido y “células generadoras de brotes de espigas”, que presentan los potenciales de acción agrupados en forma fásica. Además de su patrón de disparo, otras dos variables utilizadas para realizar la anterior clasificación son la morfología de los potenciales de acción y la variación de la frecuencia instantánea de las espigas con el aumento de intensidad del estímulo (Connors y Gutnick, 1990). Aunque no existe una relación inequívoca entre la morfología y el patrón de disparo de las neuronas corticales, se admite que las células de disparo rápido son neuronas no piramidales, posiblemente interneuronas inhibidoras (McCormick et al., 1985), mientras que las células de disparo regular y las generadoras de brotes son células piramidales o estrelladas espinosas, constituyendo las células excitadoras del cortex (Landry, Wilson y Kitai, 1984; McCormick et al., 1985). La modificación de la frecuencia de disparo en el tiempo implica que la respuesta neuronal cambia aún cuando la información excitatoria aferente se mantenga constante. Esta propiedad tiene una evidente funcionalidad en la organización espacio-temporal del cerebro ya que puede estar involucrada, por ejemplo, en la discriminación que éste realiza entre estímulos novedosos y los que no lo son. En otras estructuras cerebrales, como el colículo superior, la adaptación que sufre el disparo neuronal puede presentar una constante de tiempo similar a la observada en la adaptación sensorial (Llinás y López-Barneo, 1988). Cómo el cerebro utiliza los diferentes patrones de disparo de las células neocorticales en la elaboración de la información es una pregunta que sigue abierta. La adaptación del tiempo neuronal puede mediar por tanto fenómenos “plásticos” de corta duración, pero en las neuronas ocurren además otras modificaciones que también alteran su relación entrada-salida, y que se basan en la plasticidad de sus relaciones sinápticas. Estas modificaciones pueden ser duraderas, permitiendo aprovechar las experiencias adquiridas durante el desarrollo ontogénico para conseguir una mejor adaptación al medio externo. Los dos primeros trabajos que mostraron una alteración de larga duración en una relación sináptica, aparecieron en 1973 describiendo una potenciación que ocurría en las células del giro dentado del hipocampo, al realizar una estimulación tetánica de la vía perforante. Esta potenciación duraba horas en el animal anestesiado (Bliss y Lomo, 1973) y semanas si se realizaba en el animal despierto (Bliss y Gardner-Medwin, 1973). Posteriormente este fenómeno se describió en el área CA1 del hipocampo (Schwartzkroin y Wester, 1975; Lynch, Dunwiddie y Gribkoff, 1977), área CA3 (Alger y Teyler, 1976) y en muchas otras localizaciones del sistema nervioso entral (subiculum, septum, cortex cerebelar, núcleos cerebelares, neocortex,…). Para que esta potenciación se produjese se comprobó que era necesaria la activación de un subtipo de los receptores glutamatérgicos, los receptores para N-metil-D-aspartato (NMDA) (Collingridge, Kehl y McLennan, 1983; Harris, Ganong y Cotman, 1984). El estudio de las propiedades de los receptores NMDA en la aferencia que las células piramidales del área CA1 del hipocampo reciben desde el área CA3 por la colateral de Schaffer, es especialmente apropiado pues es dentro del sistema nervioso central una de las aferencias sinápticas que presenta mayor densidad de receptores NMDA en base a los estudios de marcaje autoradiográfico (Monaghan, Holets, Toy y Cotman, 1983, Monaghan, Yao, Olverman, Watkins y Cotman, 1984), y muestra una pronunciada potenciación en los estudios electrofisiológicos realizados en secciones de hipocampo (Schwartzkroin y Wester, 1975; Alger y Teyler, 1976). Estos receptores tienen un canal iónico asociado, que permite el paso de Ca2+ y otros cationes al interior de la celular, cuando la célula postsináptica está suficientemente despolarizada como para que se elimine el bloqueo que ejerce el Mg2+ en el canal (Mayer y Westbrook, 1987; Ascher y Nowak, 1988). La entrada de Ca2+ puede activar a kinasas (proteína kinasa C y Ca2+/calmodulina kinasa), proteasas (calpainas) y fosfatasas (calcineurina), que pueden estar involucradas en las modificaciones metabólicas responsables de las alteraciones sinápticas derivadas de la activación de los receptores NMDA. Los receptores NMDA participan también en otro tipo de modificaciones de la respuesta sináptica como son el “kindling” (Slater, Stelzer y Galvan, 1985; Mody y Heinemann, 1987; Gean, Shinnick-Gallager y Anderson, 1989) y las respuestas epilépticas (Herron, Williamson y Collingridge, 1985; Dingledine, Hynes y King, 1986; Hablitz y Langmoen, 1986). El “kindling” consiste en hacer epileptogénica una zona del sistema nervioso central en el animal completo, para lo que se estimula una aferencia a esta área diariamente con un estímulo tetánico (normalmente 60 Hz durante 1 s), con lo que aparece un componente polisináptico (o postdescarga) en la respuesta, que aumenta con los días en duración, amplitud y frecuencia, y finalmente origina un ataque epiléptico en el animal (Mody y Heinemann, 1987; Gean et al., 1989). Aunque la potenciación de larga duración y el “kindling” tienen protocolos de inducción semejantes y ambos resultan en un aumento duradero de la respuesta sináptica a un estímulo, existen rasgos diferenciales entre ambos fenómenos. Mientras que la potenciación (Cain, 1989) y mientras que los antagonistas específicos de los receptores NMDA impiden la inducción de aquella en algunas localizaciones como las neuronas piramidales del área CA1 (Collingridge y Bliss, 1987), retrasan pero no impiden el desarrollo del “kindling” y de la actividad epiléptica (Herron et al., 1985; Hablitz y Langmoen, 1986; Cain, 1989). Por otra parte el “kindling” facilita la respuesta a sustancias que provocan ataques epilépticos y se favorece por la aplicación repetida de estos agentes (Cain, 1989). Por todo lo anterior el kindling se considera un modelo para estudiar la epilepsia mientras que la potenciación a largo plazo no. Los mecanismos moleculares subyacentes a todos estos tipos de cambios “plásticos” en las sinapsis no han sido aún establecidos, pudiendo participar en ellos modificaciones de las proteínas del citoesqueleto, que medien los cambios morfológicos observados en las espinas dendríticas tras la potenciación de la eficacia sináptica (Fifkova y Van Harreveld, 1977; Chang y Greenough, 1984; Morales y Fifkova, 1989; Calverley y Jones, 1990; Friedrich, 1990). De particular interés a este respecto resulta la proteína tipo 2 asociada a los microtúbulos (MAP2), que es especialmente abundante en las densidades postsinápticas de las espinas dendríticas (Cáceres, Banker, Steward, Binder y Payne, 1984; Morales y Fifkova, 1989) y cuyo estado de fosforilación parece regular su unión al citoesqueleto (Murthy y Flavin, 1983; Hoshi, Akiyama, Shinohara, Ogawara, Nishida y Sakai, 1988; Díaz-Nido, Serrano, Hernández y Ávila, 1990; Brugg y Matus, 1991). La capacidad adaptativa del sistema nervioso central al mundo externo, se basa por tanto en modificaciones en estado funcional de las neuronas. Estos cambios dependen, por un lado, del tipo y distribución de los canales iónicos dependientes de voltaje los cuales determinan las propiedades intrínsecas de las células y su patrón de respuesta electrofisiológica. Por otro lado, la eficacia sináptica, factor que dependen de canales regulados por los neurotransmisores y que determinan el “status” de los circuitos sinápticos, es susceptible de modificación, lo que permite el aprendizaje y la integración de la experiencia acumulada por cada individuo en el esquema organizativo básico de su sistema nervioso. En base a lo indicado anteriormente los objetivos generales de este trabajo han sido el estudio de los mecanismos responsables a nivel celular de las adaptaciones temporales en la características electrofisiológicas de los elementos neuronales. En neuronas de la corteza visual se han estudiado sus propiedades electrofisiológicas intrínsecas y las conductancias iónicas subyacentes, con especial atención a la adaptación a corto y largo plazo en el disparo neuronal. Por otra parte, en las células piramidales del área CA1 de la corteza hipocámpica, se han analizado los cambios que la aplicación de NMDA y la despolarización producen en su respuesta sináptica y las modificaciones que de forma paralela ocurren en el estado de fosforilación de la MAP2. Los objetivos específicos han sido: 1. Estudio de los patrones de disparo de las neuronas de la capa II-III de la corteza visual del cobaya, con pulsos intracelulares de corriente. 2. Análisis farmacológico de la respuesta subumbral y supraumbral obtenida con estos pulsos de corriente. 3. Estudio de la adaptación a corto y largo plazo en el disparo repetido de potenciales de acción en estas neuronas corticales. 4. Análisis de los componentes de la respuesta sináptica en neuronas piramidales del área CA1, al estimular en el stratum radiatum del hipocampo. 5. Caracterización del efecto en la respuesta sináptica de la aplicación de NMDA a la sección de hipocampo y su comparación con la acción de la despolarización inducida mediante alto potasio extracelular o con corriente continua. 6. Estudio del efecto de NMDA y alto potasio extracelular en el estado de fosforilación de la MAP2