Papel de ALPHA-TAT1 en la dinámica del centrosoma

Los centriolos son considerados la estructura microtubular que contiene la γtubulina más altamente modificada dentro de la célula. De entre todas las modificaciones post-traduccionales que éstos presentan se encuentra la acetilación; los MTs de los centriolos aparecen altamente acetilados. Sin embargo, aún no ha sido dilucidado el papel de esta modificación post-traduccional en la integridad, dinámica y función de este orgánulo. Nuestros resultados estatuyen que esta modificación post-traduccional es un evento muy temprano en el proceso de formación del procentriolo durante la duplicación centriolar, lo que sugiere una función esencial de la acetilación en el punto de inicio de este proceso. La única enzima con actividad tubulina acetil-transferasa hasta ahora identificada, es la proteína αTAT1, no obstante, jamás ha sido realizado un análisis preciso de la distribución y el papel de la misma en este orgánulo celular. En este trabajo hemos revelado que la proteína de fusión GFP-αTAT1 se encuentra localizada en el centrosoma durante la interfase. Asimismo, los resultados presentados en esta tesis demuestran que αTAT1 es suficiente y necesaria para acetilar no sólo la αtubulina citoplasmática sino también la αtubulina centriolar, revelando que esta enzima es la responsable de esta modificación en los centriolos, siendo reclutada al centrosoma o al cuerpo basal para servir como punto de inicio y preparación para el desarrollo de otras funciones centriolares. Tres líneas argumentales demuestran un papel esencial de αTAT1 en el proceso de reclutamiento del material pericentriolar al centrosoma tanto en células HeLa como en MEFs. Primero, la inhibición de la expresión de αTAT1 en ambos tipos celulares ocasiona una evidente perturbación en la distribución de las proteínas que constituyen el material pericentriolar, sin alterar la distribución de las proteínas estrictamente centriolares. En estas condiciones, se observa un enriquecimiento significativo de las proteínas pericentriolares localizadas en la región centrosómica. Segundo, mediante experimentos de FRAP, hemos investigado si estas proteínas son inmovilizadas después de su reclutamiento al centrosoma o se encuentran en continuo intercambio con la fracción citoplásmica. Los resultados de estos experimentos indicaron que en ausencia de αTAT1, las proteínas pericentriolares no son inmovilizadas después de su reclutamiento al centrosoma sino que se encuentran en continuo intercambio con la fracción citoplásmica libre y a una tasa de difusión casi dos veces más rápida que la observada en células control, demostrando un papel de esta enzima en la estabilización de la unión de la fracción citoplásmica de estas proteínas al centrosoma y consecuentemente en el comportamiento dinámico de las mismas. Tercero, nuestros ensayos de co-inmunoprecipitación han aseverado que αTAT1 es capaz de interaccionar con las proteínas AKAP450 y γtubulina, las cuales son componentes básicos del material pericentriolar. En conjunto, estos resultados apoyan la siguiente hipótesis: αTAT1 regularía tanto el reclutamiento al centrosoma como el comportamiento y la distribución de las distintas proteínas pericentriolares mediante su interacción con AKAP450. En realidad, dado su enorme tamaño y la cantidad de interacciones que establece, descritas o por descubrir, AKAP450 puede ser considerada una “plataforma proteica” más que una simple proteína. De forma que vía esta asociación, αTAT1 sería capaz de mediar la localización centrosómica de AKAP450 y a su vez de PCNT (pues ha sido descrito que AKAP450 interacciona con PCNT y ambas son interdependientes para su localización en el centrosoma -Barr, Kilmartin, & Gergely, 2010; Buchman et al., 2010; M Takahashi, Yamagiwa, Nishimura, Mukai, & Ono, 2002-) y del resto de proteínas pericentriolares, regulando sus propiedades dinámicas y estabilizando la unión de las mismas al centrosoma. En el caso del complejo del γ-TuRC, αTAT1 podría reclutarlo al centrosoma de forma indirecta via su interacción con AKAP450, quien a su vez interacciona con los componentes GCP2/GCP3 del γ-TuRC o bien de forma directa via su interacción con γtubulina. Estos resultados revelan un papel crucial de la enzima αTAT1 en la determinación del tamaño del centrosoma definiendo la capacidad de los centriolos de unir PCM, mediante su interacción con varias proteínas pericentriolares y la regulación del reclutamiento dinámico de éstas al centrosoma. Los resultados obtenidos a partir de los experimentos de despolimerización de MTs revelaron que los MTs citoplásmicos no juegan un papel crítico en el reclutamiento de las proteínas pericentriolares mediado por αTAT1. No ha sido identificado aún el mecanismo preciso por el que las proteínas del PCM son reclutadas al centrosoma. Estas observaciones arrojan luz sobre la maquinaria molecular involucrada en este proceso, estatuyendo un papel importante de la enzima αTAT1 en la restricción y control del número de moléculas de AKAP450 y γtubulina que deben ser reclutadas e inmovilizadas en los centriolos, de forma que cuando la expresión de αTAT1 es inhibida se produce una desregulación de este proceso y se detecta una superabundancia de moléculas de estas proteínas y demás proteínas pericentriolares en la región centrosómica, las cuales se encuentran en continuo intercambio con la fracción citosólica. Nuestros ensayos de repolimerización de MTs han demostrado un papel esencial de αTAT1 en el proceso de nucleación de MTs dentro de la célula. La inhibición de la expresión de αTAT1 incrementa de forma significativa la tasa de nucleación de MTs en el centrosoma desencadenando la formación de una red microtubular completamente radial y simétrica. Esto concuerda con los resultados previamente descritos en los que se establece que la tasa de nucleación de MTs en el aparato de Golgi es proporcional a la cantidad de AKAP450 presente en esta región. Nosotros hipotetizamos que el mecanismo de regulación de la nucleación microtubular en el centrosoma es similar al detectado en el aparato de Golgi, existiendo una relación proporcional entre la cantidad de AKAP450 asociada al centrosoma y el número de MTs que son nucleados por este orgánulo. En ausencia de αTAT1, el enriquecimiento de moléculas de AKAP450 en el centrosoma desencadenaría un incremento significativo en la tasa de nucleación de MTs a partir de esta estructura subcelular. Asimismo, la morfología de los MTs nucleados por los centrosomas carentes de αTAT1 difiere significativamente de la presentada por los MTs formados a partir de centrosomas control. En ausencia de αTAT1, los MTs son mucho más rectos y de menor longitud que los observados en condiciones control, lo que sugiere que esta proteína participa en la determinación de la estructura microtubular. Adicionalmente, hemos evidenciado una labor decisiva de γTAT1 en la estabilidad centriolar y en el des-ensamblaje del cartwheel. Hemos observado que la inhibición de la expresión de αTAT1 en células bajo situaciones de estrés provoca eventos de sobreduplicación centriolar que resultan en husos mitóticos malformados, implicando un vínculo funcional entre αTAT1 y los eventos que tienen lugar en el centrosoma. La interpretación más simple es que αTAT1 es un componente de esta estructura subcelular requerido para la estabilidad centriolar vía la inmovilización de las distintas proteínas pericentriolares al centrosoma. Por otro lado, hemos patentizado que αTAT1 juega un papel crucial en la degradación centriolar de sas6 que tiene lugar en anafase. Nuestros experimentos han desvelado que la ausencia de αTAT1 impide la degradación centriolar de sas6 al final de mitosis, sugiriendo que αTAT1 es esencial para el adecuado des-ensamblaje del cartwheel en este punto del ciclo celular. Al igual que ocurre en el caso de los cuerpos basales, la permanencia del cartwheel bajo condiciones de inhibición de la expresión de αTAT1 podría servir como mecanismo para estabilizar los centriolos ya que, como mencionábamos anteriormente, la estabilidad centriolar se encuentra significativamente comprometida en las células carentes de αTAT1. En células mitóticas la cantidad de los componentes del cartwheel disminuye considerablemente para prevenir una duplicación inapropiada. Estos datos indican que los eventos de sobreduplicación centriolar y el ensamblaje de husos mitóticos multipolares que tienen lugar en células carentes de αTAT1 bajo situaciones de estrés son debidos a una reducción de la estabilidad centriolar junto con defectos importantes en el des-ensamblaje del cartwheel al final de mitosis. Curiosamente, el papel de αTAT1 tanto en la dinámica y distribución de las proteínas pericentriolares como en la estabilidad centriolar no ha sido observado en células RPE1. No se ha dilucidado aún la razón de este diferente comportamiento. Una posibilidad es que estas células carezcan de algún factor todavía no identificado necesario para la función de αTAT1 relacionada con la estabilidad y función centrosómicas, indicando que esta precisa labor de αTAT1 es dependiente del tipo celular. Por otro lado, también hemos examinado la implicación de la proteína γTAT1 en la dinámica del aparato de Golgi. La subpoblación de microtúbulos cortos que comienzan y acaban en el aparato de Golgi (incluso a veces paralelos a las cisternas de este orgánulo) y que suelen presentar modificaciones post-traduccionales, especialmente la modificación consistente en la acetilación, es una característica de la mayoría de los tipos celulares. De esta forma, se propuso que estos microtúbulos generados en el aparato de Golgi y modificados post-traduccionalmente podrían desempeñar funciones específicas en la dinámica del aparato de Golgi. Todos estos datos nos impulsaron a indagar en el papel que desempeña la acetilación de microtúbulos mediada por αTAT1 en la dinámica del aparato de Golgi. Nuestros resultados ponen de manifiesto que ni una perturbación en el nivel de acetilación de MTs ni en la expresión de la enzima αTAT1 provoca defectos en la localización pericentrosomal o en la estructura del aparato de Golgi. Estos datos indican que los MTs acetilados no juegan un papel determinante en la posición central del aparato de Golgi ni son responsables de la morfología extendida que adopta este orgánulo en células en interfase que están creciendo en un sustrato finito. Tampoco las funciones básicas del aparato de Golgi, especialmente la secreción, parecían estar seriamente afectadas. La formación de intermediarios de transporte ocurre de forma normal bajo condiciones en las que el nivel de acetilación de la tubulina se encuentra seriamente perturbado, apuntando a que si la acetilación de los MTs participa en el tráfico de membranas, será de forma indirecta, pàrticipando en la secreción polarizada pero no en los mecanismos básicos de transporte