Untersuchungen zur Identifikation des ursächlichen Gens in einer konsanguinen Familie mit Achromatopsie

Das reguläre Farbensehen wird als Trichromasie bezeichnet. Dies bedeutet, dass in drei unterschiedlichen Zapfentypen Photopigmente für kurz-, mittel- und langwelliges Licht funktionstüchtig sind und dadurch das Farbensehen ermöglichen. Als Dichromasie wird eine Form der angeborenen Farbenblindheit bezeichnet, bei welcher zwei der drei Zapfentypen funktionieren. Die Betroffenen können nicht alle Farbempfindungen differenzieren, man unterscheidet die Protanopie/Protanomalie, die Deuteranopsie/Deuteranomalie und die Tritanopie/Tritanomalie. Bei der Blauzapfenmonochromasie (BCM) funktionieren nur noch die kurzwelligen Blauzapfen und die Stäbchen. Die BCM wird deshalb auch als inkomplette Achromatopsie bezeichnet. Bei der kompletten, kongenitalen Achromatopsie besteht aufgrund genetischer Defekte, welche autosomal-rezessiv vererbt werden, keine Wahrnehmung durch die Zapfen. Die Stäbchen sind die einzigen Photorezeptoren, die bei Patienten mit kompletter Achromatopsie ordnungsgemäß arbeiten. Ursächliche Mutationen sind bisher in sechs Genen beschrieben worden: CNGA3-Gen, CNG3B-Gen, GNAT2-Gen, PDE6C-Gen, PDE6H–Gen und im ATF6-Gen. Mit diesen sechs Genen konnten lediglich etwa 80% der Achromatopsiepatienten beschrieben werden. Ziel dieser Dissertation war es in einer konsanguinen Familie mit drei Betroffenen die an einer kongenitalen Achromatopsie litten die ursächliche Mutation zu identifizieren. Die bis dahin bekannten Genorte für die Achromatopsie waren für die Familie durch Kopplungsanalysen ausgeschlossen worden. Die drei Betroffenen waren im Vorfeld mit dem Affymetrix Gene Chip® Human Mapping 10K Array Xba 142 typisiert worden, woraus sich eine Assoziation mit einem Genort auf Chromosom 2q23.2-24.3 ergab. Zur weiteren Eingrenzung des Kandidatenlocus wurde eine parametrische Kopplungsanalyse mittels Short Sequence Repeat (SSR) Markern durchgeführt, die auf den angrenzenden chromosomalen Bereich 2q31.1-2q33.3 ausgedehnt wurde. In der parametrischen Kopplunganalyse konnte keine weitere Eingrenzung des Kanditenlocus durchgeführt werden. Daher wurde in frei verfügbaren Gendatenbanken nach potentiellen Kandidatengenen im Bereich von Chromosom 2q31.1-2q33.3 gesucht, die retinal exprimiert werden. Insgesamt waren 148 Gene in dem Bereich lokalisiert, wovon 14 retinal exprimiert waren. Drei Kandidatengene (C2orf69, PDE6D, MPP4) wurden als potentielle Kandidatengene durch Sequenzierung untersucht und ausgeschlossen. Zur Untersuchung des Kandidatenbereiches wurde eine Exomsequenzierung des Patienten 508.08 als schnellste technisch verfügbare Methode durchgeführt. Diese erbrachten den homozygoten Nachweis der c.1148delC Mutation im CNGB3-Gen. Die Mutation wurde bei der betroffenen Cousine 2ten Grades 508.16 ebenfalls homozygot nachgewiesen. Die betroffene Mutter 508.05 des Patienten 508.08 war hingegen heterozygot für die Mutation. Durch diesen Bruch in der Verwandtschaftslinie erklären sich die Ergebnisse der Kopplungsuntersuchungen, die von einer gemeinsamen ursächlichen genetischen Veränderung bei allen drei Patienten ausgegegangen waren. Im weiteren Verlauf musste nun die genetische Ursache für die Achromatopsie der Betroffenen 508.05 identifiziert werden. Nach einer Exomsequenzierung der DNA der Betroffenen 508.05 wurden die Daten mit den WES Daten des Betroffenen 508.08 gegen abgeglichen und auf gemeinsame Sequenzveränderungen überprüft. Der Abgleich der identifizierten Sequenzveränderungen zwischen den Betroffenen 508.05 und 508.08 ergab mögliche ursächliche Mutationen in 7 Genen die retinal exprimiert wurden. In die nähere Auswahl kamen Mutationen im OR2M3-Gen – welche ein Start- und Stopcodon betrafen – und Mutationen im CTBP2-Gen. Letzlich hielt aber nur die Kombination im CTBP2-Gen einer Segregationsanalyse und einer funktionellen Bewertung stand. Es zeigten sich 2 Mutationen in Form von Leserasterverschiebungen. Aufgrund der Lokalisation in den Ribbonsynapsen der Photorezeptoren und Bipolarzellen kann das CTBP2-Gen als geeignetes Kandidatengen betrachtet werden. Da CTBP2 in Zapfen und Stäbchen der humanen Retina exprimiert ist bleibt zu klären, in welchem funktionellen Zusammenhang das CTBP2-Gen mit der im Vordergrund stehenden Fehlfunktion der Zapfen steht und in wieweit die Stäbchenfunktion von den vorliegenden Mutationen beeinflusst wird.Colour vision is present in men as trichromacy. This includes three different types of cones with photopigments sensitive to short, middle and long wavelength light. Dichromacy describes one form of the congenital colour blindness with only two of three cone types functioning. The patients are unable to differentiate all colour sensations.Three forms of dichromacy are described: protanopia/protanomaly, tritanopia/tritanomaly and deuteranopia/deuteranomaly. The Blue cone monochromacy is a disorder with residual function in short-waves cones and rods only. Blue cone monochromacy is also called incomplete achromatopsia. Complete, congenital achromatopsia presents with absent cone function based on an autosomal-rezessively inherited genetic defect. Rods are the only photoreceptors that work in complete achromatopsia. Mutations in 6 genes underly achromatopsia: CNGA3-gene, CNGB3-gene, GNAT2-gene, PDE6C-gene, PDE6H-gene and ATF6-gene. But these genes could describe only about 80% of achromatopsia cases. The aim of this thesis was the identification of the underlying mutation in a consanguineous family of achromatopsia with three affected members. The previously identified loci for achromatospia were excluded in advance. The three affected family members were genotyped using the Affymetrix Gene Chip® Human Mapping 10K Array Xba 142. An association study revealed chromosome 2q23.2-24.3 as a possible candidate region. To further delineate the candidate locus, a parametric linkage analysis was performed using Short Sequence Repeat (SSR) markers, which covered an extended adjacent chromosomal region 2q31.1-2q33.3. In the parametric linakge analysis, no further refinement of the candidate locus was possible. Therefore, open access genetic databases, were screened for potential retinal expressed candidate genes on chromosome 2q31.1-2q33.3. A total of 148 genes were localized in the region of which 14 were retinal expressed. Three candidate genes (C2orf69, PDE6D, MPP4) were studied as potential candidate genes by sequencing and excluded. To examine the candidate range, a whole exome sequencing (WES) of patient 508.08 was carried out as the fastest technically available method. This identified a homozygous deletion in the CNGB3-gene (c.1148delC). The mutation was also found homozygous in the second cousin 508.16, who was affected also. The affected mother 508.05 of patient 508.08, however, was heterozygous for the mutation. The failure of linkage analysis, which resulted from the erroneous assumption of a common genetic cause in all three patients, was explained by this. In the further course, the genetic cause of achromatopsia in patient 508.05 was approached by an additional WES. The data of the WES was compared to the data of patient 508.08 and checked for common sequence changes. The comparison of the identified sequence changes between patients 508.05 and 508.08 revealed possibly underlying mutations in 7 genes expressed in the retina. Segregation of mutations identified in the OR2M3-gene - which involved a start and stop codon - and two frameshift mutations in the CTBP2-gene were analysed in the family. However, only CTBP2-gene mutations segregated in the family. Because of its expression in cone and rod photoreceptors the CTBP2-gene was considered as the suitable candidate gene. In which functional context CTBP2-mutations affect rod function and lead to a prominent functional deficit of cones needs to be investigated in particular in the further studies