Estudio toxicológico y electrofisiológico de ficotoxinas marinas: Mecanismo excitotóxicos y apoptóticos en cultivos primarios de neuronas

Tesis con mención internacionalLos cultivos primarios de neuronas de cerebelo han mostrado ser un modelo muy eficaz en estudios toxicológicos de ficotoxinas marinas y mecanismos de excitotoxicidad glutamatérgica. En este trabajo se ha complementado el estudio de mecanismos de toxicidad neuronal y glial de varias ficotoxinas, con la determinación de sus efectos en la actividad eléctrica de neuronas con la técnica de matrices de microelectrodos (MEA). Las ficotoxinas fueron divididas en dos grupos: 1) nuevas ficotoxinas aisladas del dinoflagelado Prorocentrum belizeanum y asociadas con la Intoxicación Diarreica por Mariscos (DSP): Belizeanólido, ácido belizeanólico, belizentrina, ácido 19-epi-okadaico (19-epi-OA) y ácido prorocentroico; y 2) ficotoxinas ampliamente conocidas como palitoxina (PlTX) y ácido domoico (DOM). Se han podido identificar procesos apoptóticos en la muerte neuronal inducida por el ácido belizeanólico (la forma más tóxica y abierta del macrólido belizeanólido) y la belizentrina (un macrólido), con una afectación temprana de las neuritas y una EC5024 en neuronas en el rango micro y nanomolar, respectivamente, y menor potencia tóxica en células gliales para ambas toxinas. En el caso del 19-epi-OA, su menor potencia tóxica con respecto a su análogo estructural el OA, fue debida principalmente a su menor capacidad de inhibición de la proteín fosfatasa 1. Las ficotoxinas PlTX y DOM fueron estudiadas debido a su efecto sinérgico en neuronas entre concentraciones no tóxicas y su relevancia para la salud humana en potenciales contaminaciones algales. La toxicidad de la PlTX se caracterizó por primera vez en células gliales con una EC5024 de 300-400 pM, similar a las neuronas, pero con un mecanismo de toxicidad diferente que no fue prevenido por DIDS ni implicó procesos apoptóticos. El estudio del sinergismo entre PlTX y DOM mostró que concentraciones no tóxicas de PlTX indujeron un incremento de los niveles de ARNm que codifican genes de expresión rápida (IEGs), alcanzando su pico máximo a las 5 h de exposición a la toxina. A estos tiempos, la PlTX incrementó la excitotoxicidad del DOM, mientras que exposiciones más largas (48 h) no incrementaron ni protegieron de la excitotoxidad del DOM, aunque fueron efectivas bloqueando la toxicidad del glutamato. Para comprobar si la disminución de la toxicidad del glutamato tras la exposición a PlTX era atribuible a una reducción de la respuesta a través del receptor NMDA o a otros mecanismos de protección, se facilitó la respuesta excitotóxica reduciendo la síntesis de ATP mediante la exposición de las neuronas a cianuro. En estos experimentos se observó que inhibidores de algunos canales aniónicos como el DIDS, capaces de inhibir la toxicidad de la PlTX, fueron capaces de inhibir también la toxicidad del cianuro. Además GMPc y AMPc protegieron frente la toxicidad del cianuro, modulado mediante la activación de los receptores NMDA y la entrada de calcio. Con el fin de establecer las concentraciones más bajas que alteran la fisiología celular, la técnica de MEA permitió determinar la actividad eléctrica extracelular de las neuronas a diferentes tiempos de exposición a las ficotoxinas, aprovechando la posibilidad de registrar en condiciones fisiológicas durante largos periodos de tiempo. Debido a que la actividad eléctrica de las neuronas granulares de cerebelo no fue lo suficientemente robusta como para ser registrada se utilizaron en su lugar neuronas corticales que mostraron una potente y sincrónica actividad eléctrica espontánea tras la segunda semana en cultivo. Esta actividad espontánea empezó a desarrollarse después de pocos días en cultivo y fue principalmente dependiente de la actividad glutamatérgica y GABAérgica. La mayoría de ficotoxinas probadas modificaron la actividad eléctrica espontánea a concentraciones menores que las concentraciones subtóxicas usadas en estudios de toxicidad, y todas las ficotoxinas del grupo DSP así como la PlTX redujeron la actividad eléctrica. La PlTX fue la más potente, reduciendo la actividad eléctrica a concentraciones tan bajas como 10 pM, mientras que la concentración subtóxica más alta fue 100 pM. El DOM fue la única toxina capaz de incrementar la actividad eléctrica espontánea a concentraciones entre 100 y 500 nM. Concentraciones más altas, dentro del rango no tóxico, redujeron rápidamente la actividad eléctrica espontánea. No se observó un efecto potenciador del DOM por la PlTX en la actividad eléctrica espontánea, sugiriendo que esta potenciación podría ocurrir solo en condiciones pre-tóxicas