Regulación de la supervivencia celular por sobreexpresión de NOS3 en la línea de hepatoma HepG2

El hepatocarcinoma (CHC) representa la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en el mundo. Además, debido a su relación con otras patologías como la diabetes o la obesidad, su incidencia y mortalidad asociada siguen en aumento. La esperanza de vida de la mayoría de los pacientes de CHC es corta y, en la mayoría de los casos, solamente la ablación percutánea de tumores pequeños, la cirugía de resección y el trasplante hepático son capaces de curar la enfermedad. No obstante, debido a que el diagnóstico del CHC suele realizarse en estadios avanzados de la enfermedad, el porcentaje de casos con probabilidad de recibir alguno de los tratamientos curativos se sitúa entre el 40-50%. Por ello, es necesario obtener un mayor conocimiento de la enfermedad que nos permita el desarrollo de nuevas terapias frente al CHC. Las líneas tumorales establecidas son valiosos modelos en investigación oncológica y, aunque no pueden reemplazar a los ensayos in vivo, constituyen una alternativa muy útil. El óxido nítrico (ON) es una molécula químicamente inestable y de vida media muy corta, la cual puede ser sintetizada en muchos tejidos (incluido el hepático) a partir de las óxido nitrico sintasas (NOS). El ON desempeña un relevante papel fisiopatológico en la transducción de la señal, ejerciendo diferentes efectos en función de distintos factores. El papel del ON como regulador de la apoptosis está bien establecido, pudiendo actuar como agente pro- o antiapoptótico. Sin embargo, el mecanismo molecular responsable de este efecto contradictorio no se conoce con profundidad. Como proapoptótico, el uso de donadores de ON ha sido sugerido como potencial terapia frente al cáncer. En este sentido, la sobreexpresión de la óxido nítrico sintasa endotelial (NOS3) también ha sido relacionada con la muerte celular a través del incremento del estrés nitro-oxidativo celular y de la expresión de p53 y del receptor de muerte Fas, y ha sido sugerida como posible terapia génica frente al cáncer. El objetivo de esta tesis fue identificar el mecanismo a través del cual la sobreexpresión de NOS3 se relaciona con la actividad antitumoral, en la línea celular de CHC humano HepG2 con sobreexpresión estable de la NOS3 (4TO-NOS). Asimismo, hemos valorado la sensibilidad de la línea 4TO-NOS a la muerte celular inducida por anti- Fas. Para ello, y considerando la naturaleza del ON y sus efectos fisiológicos, analizamos la localización de la NOS3, el efecto del ON sobre la cadena de transporte electrónico mitocondrial y el perfil de expresión diferencial de proteínas en la línea celular 4TO-NOS. Nuestros resultados demostraron que NOS3 se localiza en la membrana mitocondrial externa. La sobreexpresión de NOS3 se asoció con el incremento del contenido mitocondrial de proteínas nitradas, pero no con la alteración de la capacidad respiratoria celular. En este sentido, se observó un incremento del número de copias de ADN mitocondrial en la línea 4TO-NOS, que coincidió con una mayor expresión de proteína del complejo IV mitocondrial. La muerte celular y el estrés oxidativo relacionados con la sobreexpresión de NOS3 fueron asociados al incremento de la expresión de genes proapoptóticos y a una mayor expresión/actividad de las enzimas adrenodoxina oxidorreductasa mitocondrial (AR) y catepsina D (CATD). Interesantemente, la sobreexpresión de CATD en la línea celular 4TO-NOS se relacionó con la inducción de apoptosis de manera independiente a su actividad catalítica. Además, la inhibición de la actividad CATD no fue efectiva en bloquear la apoptosis inducida por anti-Fas. En resumen, la sobreexpresión de NOS-3 resultó en una mayor sensibilidad a la muerte celular inducida por anti-Fas, independientemente de la expresión de AR y de la actividad CATD.Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause of cancer-related death in the world. In addition, due to its relationship with other pathologies such as diabetes and obesity, its incidence and associated mortality continues to increase. The life expectancy of most HCC patients is short and, in most cases, only surgery and liver transplantation are curative treatments. However, since the diagnosis of HCC is commonly made in advanced stages of the disease, the percentage of cases with the probability of receiving a curative treatment is between 40-50%. Therefore, it is necessary to obtain a greater knowledge of the disease that allows us the development of new therapies against HCC. Established tumor lines are valuable models in oncology research and, although they cannot replace in vivo assays, they are a very useful alternative. Nitric oxide (NO) is a chemically unstable molecule with a very short half-life, which can be synthesized in many tissues (including hepatic tissue) from NO synthases (NOS). NO plays a relevant role in signal transduction in pathophysiology, exerting different effects depending on several factors. The role of NO as a regulator of apoptosis is well established, having both antiapoptotic and proapoptotic functions. However, the molecular mechanisms responsible for its opposite effect are not fully understood. As antiapoptotic, the use of NO donors has been suggested as a potential cancer therapy. In this sense, the overexpression of endothelial nitric oxide synthase (NOS3) has also been related to cell death through the increase of cellular nitro-oxidative stress and expression of p53 and Fas death receptor. In addition, NOS-3 overexpression has been suggested as a therapy against cancer. The aim of this thesis was to identify the mechanism by which the NOS3 overexpression is related to the antitumor activity in the human HCC cell line HepG2 with stable overexpression of NOS3 (4TO-NOS). Also, we assessed the sensitivity of 4TO-NOS cells to anti-Fas-induced cell death. Taking into account factors such as the chemical nature of NO and its physiological effects, we analysed the location of NOS3, the effect of NO on the mitochondrial electronic transport chain and the differential expression profile of proteins in the 4TO-NOS cell line. Our results showed that NOS3 is located in the outer mitochondrial membrane. This was associated with the increase in the mitochondrial content of nitrated proteins but it was not related to altered cellular respiratory capacity. In this sense, we observed an increase in mitochondrial DNA copy number in the 4TO-NOS cell line, which coincided with a greater expression of mitochondrial IV complex protein. Cell death and oxidative stress related to NOS3 overexpression were associated with the expression increase of proapoptotic genes and with a greater expression and/or activity of adrenodoxin oxidoreductase mitochondrial (AR) and cathepsin D (CATD) enzymes. Interestingly, overexpression of CATD in the 4TO-NOS cell line was related to the induction of apoptosis independently of its catalytic activity. In addition, inhibition of CATD activity was not effective in blocking anti-Fas-induced apoptosis. In summary, the NOS3 overexpression resulted in increased sensitivity to anti-Fas-induced cell death, independently of AR expression and CATD activity