Développement d’une méthode de préconcentration SPE permettant l’identification de métabolites inconnus dans le plasma par UHPLC-HRMS

La métabolomique est un outil de phénotypage puissant en nutrition permettant de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans les processus physiopathologiques et d’identifier des biomarqueurs de déviations métaboliques. Cependant cette étape d’identification est devenue un challenge important en métabolomique et constitue un verrou analytique majeur, de par leurs diversités chimiques des métabolites présents dans les biofluides et leurs faibles concentrations. Dans ce contexte, le développement de méthodes de préconcentration est une nécessité pour pouvoir donner une signification physiologique aux profils différenciés que fournit l’analyse des données métabolomiques. Une étude préliminaire avait permis de montrer que parmi plusieurs techniques de préparation testées (SPME, SBSE et SLE), l’extraction SLE donnait les meilleurs résultats. Ce travail, qui constitue la suite du projet, a été consacré au développement de l’extraction SPE et sera par la suite comparé avec la méthode SLE préalablement testée.Pour pouvoir répondre à ces objectifs, 19 molécules de propriétés physico-chimiques diverses (pKa, logP, …) et mimant un échantillon biologique ont été sélectionnées parmi des acides aminés, des acides organiques, des hormones... Une injection de ce mélange en chromatographie semi-préparative a été réalisée afin de séparer et de collecter nos composés en plusieurs fractions. Ensuite, une extraction sur phase solide SPE a été développée pour pré concentrer ces fractions à l’aide d’un robot Freedom Evo 200 (Técan). Enfin, une analyse en mode scan sur une chaîne UHPLC Ultimate 3000 couplée à un spectromètre de masse haute résolution LTQ Orbitrap Vélos (Thermo Scientific) est réalisée afin d’évaluer les performances de la pré concentration mise en jeu.Lors de l’étape d’optimisation, la colonne semi-préparative, les cartouches SPE ainsi que les différents paramètres d’extraction (volume d’échantillon, volume et solvants de lavage, volume et solvants d’élution et le temps de séchage) ont été optimisés de sorte à obtenir les intensités les plus importantes pour un maximum de composés. Les premiers résultats obtenus montrent clairement que la cartouche SPE Oasis MCX 30mg 1 mL (Waters) est la plus performante. En effet, elle permet d’extraire, à partir de fractions chromatographiques collectées, à la fois les composés polaires et basiques mais également les composés neutres. Celle-ci est donc la cartouche de choix pour la suite de l’optimisation.Pour conclure, cette technique sera ensuite utilisée sur ces extraits concentrés en vue de réaliser des analyses structurales de potentiels biomarqueurs, pour aider à la caractérisation et à l’identification de nouveaux métabolites dans des échantillons biologique