L'angiogenesi patologica indotta da TNF-? e parzialmente inibita da un simil flavonoide sintetico

L'angiogenesi patologica è un segno distintivo di molte malattie, tra cui il cancro, le malattie infiammatorie, le metastasi tumorali, la malattia coronarica, l’artrite reumatoide e la retinopatia diabetica (1,2). Degradazione della membrana basale, proliferazione/ migrazione delle cellule endoteliali, formazione di capillari e la sopravvivenza dei neovasi sono i complessi passi sequenziali nel completamento dell'angiogenesi. Questi eventi sequenziali sono strettamente regolati da un equilibrio intricato tra molecole pro- e anti-angiogeniche (20). I fattori angiogenici includono il fattore di crescita endoteliale vascolare (vascular endothelial growth factor, VEGF), fattore di crescita di fibroblasti di base (acidic fibroblast growth factor, bFGF), angiogenina, angiopoietina, fattore di crescita epidermico (epidermal growth factor EGF)/transforming growth factor α (TGF-α), l’attivatore del plasminogeno; tra gli inibitori angiogenici sono inclusi gli alfa e beta interferoni, l’interleuchina-12 (IL-12), il TGF-beta, gli inibitori tissutali delle metalloproteinasi, il fattore piastrinico 4, e altri (12,41,55). Tra queste molecole, il fattore di necrosi tumorale-α (tumor necrosis factor, TNF-α), un solubile fattore angiogenico prodotto da molti tumori e cellule normali, svolge un ruolo chiave nella regolazione dell’angiogenesi normale e patologica (19). Su stimolazione con TNF-α, le cellule endoteliali esprimono le molecole adesive che sono cruciali nell'angiogenesi: le molecole di adesione intracellulare-1 (ICAM-1), le molecole di adesione delle cellule vascolari-1 (VCAM-1) ed la E-selectina (21). Il TNF-α aumenta la produzione di IL-8, VEGF, e bFGF, che sono tutti potenti fattori angiogenici (30). Tuttavia il TNF-α può funzionare come fattore angiogenico in un sistema e come fattore anti-angiogenico in un altro sistema e questa differenza può essere dovuta alle concentrazioni del TNF-α. Una bassa dose di TNF-α induce l'angiogenesi, ma una dose elevata la inibisce. Inoltre, lunghe esposizioni delle cellule endoteliali al TNF-α inibiscono la morfogenesi tubulare “in vitro” conferendo un aspetto cellulare simile ai fibroblasti (32). Al contrario, esposizioni più brevi al TNF-α ne inducono la morfogenesi tubulare (57). Il TNF-α induce l'espressione di molti geni immunologicamente rilevanti (68), possibilmente attraverso due differenti recettori del TNF-α, TNF-α-R1 e TNF-α-R2. Diversi studi hanno dimostrato l’abilità dei polifenoli nel modulare l’angiogenesi sia in modelli animali che “in vitro”. I polifenoli sono composti che si trovano in molti alimenti come tè, caffè, frutta, verdura, olio di oliva e vino rosso e manifestano diverse proprietà farmacologiche, ricevendo recentemente una grande attenzione come possibile supporto dietetico terapeutico in diversi stati di malattia. Nonostante siano dotati di attività interessanti sulla disfunzione ed attivazione endoteliale e come antitumorali, i loro effetti sono stati valutati a concentrazioni alte e non fisiologiche, raramente raggiungibili in circolo. Inoltre, la loro bassa solubilità e stabilità, accoppiati con proprietà farmacocinetiche sfavorevoli, e la capacità di agire su diversi bersagli molecolari e fra loro indipendenti, limitano sensibilmente il loro sfruttamento come integratori alimentari o come potenziali farmaci (1).Tuttavia, essi rappresentano una logica ed eccellente fonte di ispirazione per la chimica farmaceutica, in quanto partendo dalla loro struttura chimica si possono progettare analoghi sintetici che siano più specifici e più efficaci a basse concentrazioni. Scopo. Mossi da queste considerazioni e dal voler approfondire gli studi da noi recentemente pubblicati sui bioisosteri dei flavonoidi (2-4) abbiamo voluto verificare l’ipotesi che, analogamente al composto naturale apigenina, questa classe di bioisosteri, in particolare quello che si è precedentemente rivelato più efficace, il 2-(3,4-dimetossifenil)-3-fenil-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-one (chiamato DB103), possa modulare l’azione del TNF-α sull’angiogenesi “in vitro”. A questo scopo, abbiamo valutato gli effetti dell’apigenina e di DB103 sui livelli indotti dal TNF-α di una serie di chemochine/citochine coinvolte nell’angiogenesi: le interleuchine (IL-6, IL-8), il fattore di crescita VEGF-A l’angiopoietina-2 (Ang2) e la la proteina chemioattrattante dei monociti (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1). Metodi e Risultati. Il DB103 è stato sintetizzato presso il Dipartimento di Farmacia (brevetto: MI20120514). Il mio lavoro di tesi si è svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR e si è inserito nell’ambito del progetto di ricerca “MICROsystems for VAscular diagnosticS and inTervention” (MICRO-VAST), finanziato dalla Fondazione Pisa e a cui hanno collaborato diversi partners − fra cui il gruppo del Dipartimento di Farmacia che si è occupato della sintesi di nuovi agenti terapeutici vascolari − ed il gruppo di biologi dell’Istituto di Fisiologia Clinica che ne ha valutato l’efficacia. Per eseguire tutti gli esperimenti di questo studio sono state utilizzate cellule endoteliali umane ottenute da vene di cordone ombelicale. Poiché il composto DB103 è strutturalmente correlato ai flavonoidi, abbiamo valutato la sua efficacia mettendolo a confronto con il flavone apigenina. E’stato utilizzato il TNF-α come stimolo infiammatorio a 10 ng/mL, in costimolazione con DB103 oppure con l’apigenina, utilizzate fino a 10µmol/L o a volte 50 µmol/L. L’espressione della IL-6 e MCP-1 sono stati valutati mediante saggi immunoenzimatici del surnatante cellulare. L’espressione di IL-8, VEGF-A e di Ang2 sono stati valutati attraverso la tecnologia Luminex xMAP che si basa sull’uso di microsfere che permettono dosaggi sia in singolo che multipli per la determinazione quantitativa di proteine ed acidi nucleici. Il DB103 inibiva in maniera concentrazione dipendente l’espressione della citochina infiammatoria IL-6, indotta per 24 ore di stimolazione con il TNF-α e rilasciata nel surnatante delle colture endoteliali. Tale inibizione era comparabile a quella dell’apigenina. Similmente, esso inibiva l’espressione indotta dal TNF-α della chemochina MCP-1, contrariamente all’apigenina che risultava totalmente inefficace. L’espressione dell’Ang2 veniva inibita mentre quella dell’IL-8 risultava non influenzata dal DB103 mentre l’apigenina agiva inversamente. Siccome sono stati adoperati gli stessi surnatanti raccolti dopo 24 ore di stimolazione, i valori di VEGF-A non discostavano da quelli di controllo suggerendo che per il rilascio del VEGF-A è necessario un periodo di stimolazione maggiore. Conclusioni. Nel presente studio abbiamo dimostrato che il DB103 inibisce l'espressione endoteliale di IL-6, MCP-1 e Ang2 indotte dal TNF-α, ma non dell’IL-8. Tuttavia questi risultati non sono sovrapponibili a quelli dell’analogo apigenina, che invece agiva significativamente sull’IL-8 suggerendo che i target molecolari dei due composti sono differenti. Nuovi studi sono necessari per la caratterizzazione funzionale di questo composto al fine di chiarirne i meccanismi molecolare ed essere in grado di proporre questo composto come integratore alimentare