Impactos do zinco e do cobre em diatomáceas de água doce: resposta fisiológica, bioquímica e metabolómica de Tabellaria flocculosa

Mestrado em Biologia Molecular e CelularOs ecossistemas dulçaquícolas encontram-se sob a ameaça constante de pressões antropogénicas, nomeadamente contaminação por metais. As diatomáceas são utilizadas como indicadores de qualidade da água, contudo a influência de micronutrientes, como zinco (Zn) e cobre (Cu), e os seus possíveis impactes são pouco compreendidos. Os objetivos deste estudo passam por elucidar o nível de tolerância, os alvos e repostas celulares para contradizer a toxicidade dos metais Zn e Cu em diatomáceas de água doce, expondo Tabellaria flocculosa (TFLO), isolada de um local contaminado, a 30, 500 e 1000 μg Zn/L e 0,3, 6 e 10 μg Cu/L. Diferentes abordagens bioquímicas, fisiológicas e metabolómicas foram utilizadas. Concentrações de Zn e Cu que ocorrem em ambientes contaminados tem efeitos tóxicos nesta espécie. O Cu, este é tóxico para TFLO a concentrações comuns no ambiente que não são considerados contaminados (0.3 μg Cu/L) e a sua toxicidade aumenta com a concentração. TFLO mostrou ainda ter estratégias distintas para sobreviver à exposição a diferentes níveis de stress impostos por Zn e Cu. TFLO sobrevive a elevadas concentrações intracelulares de Zn e Cu pelo aumento das enzimas antioxidantes (SOD, CAT) e recorrendo a compostos antioxidantes de baixo peso molecular (GSH). Estes mecanismos são suportados pela elevada produção de energia (atividade ETS e ainda no caso do cobre, açucares e lípidos). Às concentrações de 1000 μg Zn/L e 6 e 10 μg Cu/L, todos estes processos metabólicos mostraram ser especialmente aumentados em acréscimo aos processos de imobilização extracelular. O aumento da imobilização extracelular (EPS e frustulinas) parece ser uma estratégia comum de combate à toxicidade do Cu. Desta forma as células procuram restringir e mitigar o stress oxidativo gerado pelo aumento das concentrações intracelulares de Zn e Cu. Contudo, estes mecanismos não foram suficientes para proteger as células de danos em membranas e proteínas, incluindo do aumento do numero de valvas com teratologias a elevadas concentrações de Zn (500 e 1000 μg Zn/L) e em todas as concentrações de Cu. Mais ainda, uma diminuição nos compostos como a sacarose e especialmente o lumicromo deveriam ser estudados futuramente como marcadores específicos da toxicidade do Zn. No caso do Cu, a diminuição do composto hidroxilamina e de ácidos gordos (FA) insaturados e o aumento dos FA saturados, 2-palmitoilglicerol, glicerol e compostos diterpenos assim como o conteúdo em clorofila c devem ser testados como marcadores específicos de exposição ao Cu. Esta informação pode suportar o melhor entendimento do modo de ação de Zn e Cu a predição da resposta da comunidade de diatomáceas de água doce em diferentes ambientes contaminados com Cu e Zn, incluindo ambientes altamente contaminados, como na exploração mineira, pode ainda ajudar no desenvolvimento de novos índices para contaminação por metais, tendo em conta a existência de espécies tolerantes e ajudando políticas de avaliação de risco ambiental.Freshwater ecosystems are under threatening anthropogenic pressures worldwide, namely metals. Diatoms are used as water quality indicators, but the impacts of micronutrients such as zinc (Zn) and copper (Cu) on diatoms are poorly understood. Our study aimed to elucidate the tolerance level, the cellular targets and the responses to counteract Zn and Cu toxicity of freshwater diatoms by exposing Tabellaria flocculosa (TFLO), isolated from a contaminated stream, to 30, 500 and 1000 μg Zn/L and 0.3, 6 and 10 μg Cu/L. Biochemical, physiological and metabolomic approaches were used. It was demonstrated that Zn and Cu are toxic to TFLO at concentrations occurring in contaminated environments. Cu was already toxic to TFLO at concentrations common in non-contaminated environments (0.3 μg Cu/L), and toxicity increased with Cu concentration. Distinct strategies to cope with Zn and Cu were shown. TFLO cells cope with intracellular high Zn and Cu concentrations by increasing antioxidant enzymes (SOD, CAT) and using low molecular weight antioxidants (GSH). These mechanisms are fuelled by a high energy production (ETS activity, and in Cu exposure sugars and lipids oxidation). At the highest Zn concentration (1000 μg/L) and 6 and 10 μg Cu/L, these metabolic processes were specially enhanced in addition to extracellular immobilization (EPS, frustulins), in an attempt to restrain the oxidative stress generated by high intracellular Zn and Cu concentrations. However, these mechanisms were not able to fully protect cells and damage in membranes and proteins occurred, including the increase of teratological valves at high Zn concentrations (500 and 1000 μg Zn/L) and Cu exposure from low to high concentrations (0.3 to 10 μg Cu/L). Additionally, the response of certain compounds was especially promising as potential markers for metals stress. For example, the decrease in sucrose and especially lumichrome should be tested as new specific markers of Zn toxicity. Additionally, the decrease of hydroxylamine and unsaturated fatty acids (FA) and the increase of saturated FA, 2-palmitoylglycerol, glycerol and diterpenoid compounds and chlorophyll c should be tested as new specific markers of Cu toxicity in future studies. This information supports the better understanding of Zn and Cu mode of action and prediction of diatom response in different Zn or Cu contamination levels, including highly impacted environments, such as mining scenarios, and may help develop new indices, taking into account species’ tolerance strategies and assist in environmental risk assessment policies