Técnicas de separação e preparo de amostras aplicadas para análise de alimentos e proteínas

O desenvolvimento de métodos de preparo de amostras é de suma importância para a análise química. Ao longo dos anos, cada vez mais os cientistas buscam técnicas para aprimorar metodologias e ferramentas matemáticas para a validação dos métodos desenvolvidos. No presente trabalho foram desenvolvidos dois diferentes métodos de preparo de amostras: um para a análise de corantes artificiais em iogurtes e posterior análise por HPLC-PAD e outro método utilizando a técnica de CE-UV/Vis para separar e fracionar amostras padrões de misturas de proteínas, seguido de um método para digestão destas e análise por LC-ESI-MS para posterior mapeamento dos peptídeos. O primeiro trabalho foi realizado para determinar a concentração de corantes artificiais em iogurtes e bebidas lácteas que são alimentos produzidos a partir da fermentação do leite sendo um alimento importante e indispensável a dieta de adultos e crianças. Para tanto foi desenvolvido um método de extração e determinação de corantes artificiais em iogurtes e bebidas lácteas por HPLC-PAD. O método foi devidamente validado e as amostras comerciais analisadas estavam de acordo com a legislação. Já o segundo trabalho visa o estudo da proteômica através do mapeamento de peptídeos. A eletroforese capilar (CE) por ser uma técnica de separação muito eficiente para a análise de proteínas e peptídeos foi utilizada na etapa inicial de preparo da amostra. A separação inicial foi seguida do fracionamento da amostra que é uma etapa muito importante e que a CE pode proporcionar, minimizando a complexidade da amostra. Posteriormente foi desenvolvido um método para a digestão das proteínas contidas em cada fração e o mapeamento dos peptídeos foi realizado com auxílio do LC-ESI-MS. Os resultados obtidos são animadores, visto que foi possível digerir as proteínas com quimotripsina em até duas horas. O que é um tempo curto se comparado a trabalhos da literatura que necessitaram de 12 a 24 horas para digestão de proteínas quando utilizadas enzimas livres em solução.The development of sample preparation methods is of paramount importance for analytical chemistry. Over the years, more and more scientists are seeking techniques to improve methodologies and mathematical tools for the validation of the methods they have developed. In this study two different methods of sample preparation were developed: one for analysis of artificial colorants in yogurts and subsequent analysis by HPLC-PAD; and another method using the CE-UV/Vis technique to separate and fractionate standard samples of protein mixtures, followed by a digestion method for these and analysis by LCESI-MS for subsequent peptides mapping. The first study was conducted to determine the concentration of artificial colorant in yoghurts and milk drinks, foods produced from the fermentation of milk that are an important and indispensable part of the food diet for adults and children. To this end, a method was developed for the extraction and determination of artificial colorant in HPLC-PAD yoghurts and milk drinks. The method was validated and commercial samples were analyzed according to the legislation. The second work is aimed at the study of proteomics by peptide mapping. Capillary electrophoresis (CE) as an effective separation technique was used in the initial stage of sample preparation for the anaysis of proteins and peptides. The initial separation was followed by fractionation of the sample which is a very important step enabled by CE, thus minimizing sample complexity. Then, a method was developed to digest the proteins contained in each fraction and the mapping of the peptides was carried out with the aid of LC-ESI-MS. The results obtained are encouraging, since the study showed that it was possible to digest proteins with free chymotrypsin within two hours. This is a short time compared to that found in the published papers requiring 12 to 24 hours for protein digestion when free enzymes in solution are used