Abordagens moleculares voltadas a caracterização funcional dos homólogos da proteína de ligação a cauda poli-A (PABP) em espécies de Leishmania sp.

Em eucariotos,a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) se liga especificamente a seqüência de poli-adenosinas na extremidade 3’ dos mRNAs, atuando em múltiplas funções associadas ao metabolismo destes, incluindo biogênese, processamento, transporte núcleo-citoplasmático e degradação. A PABP também participa na síntese proteíca, via interações diretas com fatores de tradução, como o fator de iniciação eIF4G, parceiro da proteína de ligação ao capeIF4E. O objetivo desta Tese foi dar continuidade a caracterização de três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp.(PABPs1,2 e 3), protozoários patogênicos de características biológicas diferenciadas. Em estudos prévios estas proteínas se mostraram abundantes e de expressão simultânea e a PABP1 se mostrou representada por isoformas associadas a sua fosforilação. Neste trabalho, foi observado que as três proteínas possuem localização citoplasmática, porém sob condições de inibição da transcrição, mas não de tradução ou processamento de mRNAs, as PABPs 2 e 3 migram para o núcleo. Esse comportamento está de acordo com ensaios de interação proteína-proteina, onde foi observada uma associação direta entre as PABPs 2 e 3, independente de RNA. A expressão de isoformas fosforiladas da PABP1 foi então analisada e observou-se que esta era afetada pela inibição dos processos de síntese de mRNAs. Investigando sua participação no processo de tradução, foram confirmadas interações específicas entre a PABP1 e um homólogo de eIF4G in vivo e interações inéditas entre esta e homólogos de eIF4E. As três proteínas se mostraram capazes de se associar com os polissomas de células em fase de crescimento exponencial, mas não de fase estacionária. Ao longo do trabalho foram mapeadosmotivos envolvidos com as interações observadas identificando características novas não descritas. Por fim, ensaios de co-imuno precipitação seguido de análise protéica por espectrometria de massa e de RNAs por RT-PCR confirmaram a presença de parceiros protéicos diferenciados para cada homólogo e mRNAs alvo para as PABPs 2 e 3 cuja tradução está associada a fase S do ciclo celular. Nossos resultados mostram que estas proteínas apresentam funções divergentes e reforça um papel mais geral da PABP1 na tradução.In eukaryotes, the poly-A binding protein (PABP) binds specifically to a poly-adenosines sequence present in the 3' end of the mRNAs where performes multiple functions associated with their metabolism, including biogenesis, processing, nucleocytoplasmic transport, and degradation. The PABP also participates in protein synthesis, via direct interactions with translation factors such as the initiation factor eIF4G, partner of the cap binding protein eIF4E. The aim of this Thesis was to continue the characterization of the three PABP homologues identified in Leishmaniasp. (PABPs 1, 2 and 3), a pathogenic protozoan with differentiated biological characteristics. Previous studies have shown that these proteins are abundant and simultaneously expressed and that PABP1 is characterized by multiples isoformes associated to phosphorylation. In this study, it was observed that all three proteins have cytoplasmic localization, but under transcription inhibition conditions but not translation or mRNAs processing, the PABPs 2 and 3 migrate to the nucleus. This behavior is in agreement with a protein-protein interaction observed between PABPs 2 and 3, and this interaction isindependent of RNA. The expression of the phosphorylated isoforms of PABP1 was also analyzed and it was found that some of those isoforms were affected by the inhibition of the processessing of mRNAs sinthesis. When investigated their participation in thetranslation process were observed specific interactions between PABP1 and a homolog of eIF4G in vivoand a novel interaction between PABP 1 and the homologues of eIF4E. Throughout this study the motifs involved in the interactios mentioned above were mapped and new motifs not yet described were observed. All three proteins have been shown to be associated with polysomes in cells in in exponential phase, but not in stationary phase. Finally, co-immunoprecipitation assays followed by protein analysis by mass spectrometry and of RNAs by RT-PCR confirmed the presence of different protein partners and mRNAs targets to the PABPs 2 and 3 whose translation is associated with the S phase of cell cycle. Our results show that these proteins have different functions and reinforces a more general role of PABP1 in translation