Aplicação da PCR em Tempo Real Para Detecção, Tipificaçãoe Carga Viral de Papilomavírus Bovino

O Papilomavírus bovino(BPV) é o agente etiológico da papilomatosebovina. Esta apresenta lesões que normalmente são benignas e tendem a regredir, porém podem progredir a uma neoplasia. Muitas metodologias utilizadas para detecção de BPV se mostram inespecíficas e apresentam reações cruzadas com outros organismos relacionados. No entanto, a reação quantitativa em tempo real emcadeia da polimerase (qPCR) é uma ferramenta de destaque na detecção, tipificação e quantificação de nucleotídeos e vem sendo utilizada na clínica para avaliar carga viral. O objetivo do trabalho foi desenvolver um novo protocolo de detecção, tipificação e quantificação de BPV através daqPCR. Foram desenhados cinco pares de primers, que possuem como alvo uma região conservada do genoma viral (gene L1) de diferentes BPVs. A seletividade dos primers foi testada in vitroe DNA extraído de células MDBK não infectadas foram utilizados como controle negativo. A técnica de qPCR permitiu detectar, tipificar e quantificar material viral dos BPVs 1, 2, 4, 5 e 6. O limiar relativo da detecção foi de 4fg de DNA,emtorno de 30-40 cópias de DNA/μL. Dos cinco pares de primers produzidos, quatro apresentaram mesmo perfil térmico durante a qPCR (qPCRBPV2, 4, 5 e 6), permitindo em um único procedimento detectar e tipificar os quatro tipos virais. A distinção das amostrasfoi realizada através da análise de meltingque permitiu tipificá-las. Através da metodologia desenvolvida foi observado que em lesões cutâneas de bovinos infectados com BPV a carga viral não se mostrou inferior a 1000 cópias/μL, enquanto que a técnica permite quantificar até um limiar de 40 copias de DNA/μl. Este trabalho possui relevância para validação de qPCR como diagnóstico da papilomatose bovina e particular importância quando aplicado em estudos da infecção pelo BPV e no monitoramento por veterinários da eficácia das futuras vacinas.Bovine papillomavirus (BPVs) is the etiologic agent of bovine papilomatose which is characterized by hyper proliferative lesions. Papillomas in cattle are typically benignandoften regress, but occasionally lesions can persist and progress to malignant neoplasia.The majority of current techniques for identification of BPV is unspecific andpossessescross-reactivity with closely related organisms.The Real-time quantitative polymerase chain reaction assay (qPCR) has become an exceptional tool for detection and quantification of oligonucleotides and has been utilized increasingly on viral load evaluation.Aiming to develop a new protocol for fast detection, typification and quantification of BPV in qPCR, we designed five pairs of Oligonucleotides for BPV1, 2, 4, 5 and 6 focusing on L1 gene. The qPCR primers sets were testedin vitroandMadin-Darby Bovine Kidney Cells (MDBK)DNA was also used as negative control.The Real-time qPCR assay provided an accurate detection and quantification for the BPVs 1, 2, 4, 5 and 6. The relative detection limit for the assays was 4fg or 30 to 40genome equivalents. Four primers pairs (qPCRBPV2, 4, 5 and 6) had the same annealing temperature and their products showed differences on meltingpoints analyses. Through the meltingpoint analysis, samples can be identified and discriminated as a screening and then samples can be run for viral load. In our study we tested the viral load in bovine cutaneous skin warts and observed infections with 1000 copies/μl at least. However, this assay could reach levels of 40copies/μL. In conclusion, this methodology has an important impact on the validation of qPCR as a BPV diagnosis. Its relevance is proved when applied to BPV infection studies and the monitoring of the efficacy of future BPV vaccinesby veterinarians