Þróun ónæmismeðferðar gegn sumarexemi í hestum

Insect bite hypersensitivity (IBH) is a type I allergy of horses with production of IgE and release of inflammatory mediators. It is caused by bites of midges of the genus Culicoides. The disease is a recurrent dermatitis characterized by pruritic skin and hair loss, which can result in secondary infections. All breeds of horses can be affected, but horses born in Iceland and exported are more frequently affected than Icelandic horses born abroad. Allergens have been identified at the molecular level from three Culicoides spp., C. sonorensis, C. nubeculosus and C. obsoletus. They have all been produced in E. coli and some in insect cells and barley. The aim of the study was to develop immunotherapy for IBH using vaccination with purified allergens in adjuvants and a method to treat horses via the oral mucosa with transgenic barley expressing allergens. Different injection routes and adjuvants were tested for development of prophylactic immunotherapy. Healthy Icelandic horses were vaccinated intradermally or intralymphatically with a small amount of purified allergens with or without a Th1 adjuvant. The intradermal and the intralymphatic vaccinations with adjuvant resulted in significant generation of allergen specific IgG1 and IgG4/7, the highest response being observed following intralymphatic vaccination. Furthermore, the antibodies produced after intralymphatic vaccination with the allergens in an adjuvant were able to partly inhibit binding of IgE to the allergens, an important mechanism of allergen immunotherapy. The intralymphatic route was employed to compare the immune response induced after vaccination with purified allergens in Alum alone or in a mixture of Alum and Monophosphoryl lipid A (MPLA). The vaccinated horses mounted a strong IgG1 and IgG4/7 response and the antibodies had the capacity to block the binding of IgE to the allergens. The adjuvant groups only differed with regard to the cytokine response but not in the antibody response. Compared to unvaccinated control horses, the IFNγ and IL-10 induced following in vitro restimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with an allergen was significantly higher in the Alum/MPLA but not in the Alum group. This indicated an increased Th1/Treg response after vaccination with Alum/MPLA. A spiral bit and a barley flour mixture were developed to treat horses via the mucosa of the mouth. Healthy Icelandic horses were treated with barley expressing the Cul n 2 allergen. The horses receiving the Cul n 2 barley mounted a specific IgG1 and IgG4/7 response in the sera and saliva. The antibodies induced were able to partly inhibit binding of IgE to Cul n 2 as well as to Cul o 2, the corresponding allergen from C. obsoletus. For evaluation of the benefit of immunotherapy as well as to confirm the diagnosis of IBH it is important to have recombinant allergens with similar three-dimensional structure and post-translational modification to the native proteins which can be easily purified. Barley grains are an excellent source of proteins and ideal for stable storage. Two allergens produced in barley showed similar performance in ELISA to that of the corresponding proteins expressed in E. coli and insect cells. In conclusion, intralymphatic vaccination with purified allergens in the adjuvant mixture Alum/MPLA is a promising approach for development of a prophylactic and probably also therapeutic immunotherapy against IBH. Furthermore, a first study has demonstrated that oral immunotherapy with barley expressing allergens could be an attractive alternative to conventional allergen immunotherapy, avoiding the expensive purification of recombinant allergens and the need of injection.Sumarexem er ofnæmi af gerð I í hrossum með framleiðslu á IgE mótefnum sem leiða til losunar á bólguþáttum. Ofnæmið orsakast af biti smámýs af ættkvísl Culicoides. Sumarexem er ítrekuð húðbólga og einkennist af kláða, hárlausum svæðum, sáramyndun og jafnvel sýkingum í sárunum. Útfluttir íslenskir hestar fá sumarexem í um 50% tilfella, séu þeir óvarðir á flugusvæðum, en önnur hestakyn og íslenskir hestar fæddir á flugusvæðum fá sumarexem í tíðninni 5-10%. Ofnæmisvakar úr þremur smámýs tegundum, C. sonorensis, C. nubeculosus og C. obsoletus hafa verið skilgreindir, tjáðir í E.coli og nokkrir í skordýrafrumum og byggi. Markmiðið með verkefninu var að þróa ónæmismeðferð gegn sumarexemi; bólusetningu með hreinsuðum ofnæmisvökum í ónæmisglæðum og meðhöndlun um munnslímhúð með erfðabreyttu byggi sem tjáir ofnæmisvaka. Við þróun á ofnæmisvakasértækri ónæmismeðferð voru mismunandi sprautunarstaðir og ónæmisglæðar prófaðir. Heilbrigðir íslenskir hestar voru sprautaðir í húð og í eitla með litlu magni af ofnæmisvökum með eða án Th1 stýrandi glæðis. Bólusetning í eitla og í húð með ónæmisglæði örvaði myndun á sértækum IgG1 og IgG4/7 mótefnum. Bólusetning í eitla með glæði gaf ívíð sterkara svar og mótefnin sem mynduðust hindruðu að hluta til bindingu IgE við ofnæmisvaka. Í næstu tilraun voru íslenskir hestar sprautaðir í eitla með ofnæmisvökum í Alum eða blöndu af Alum og Monophosphoryl lipid A. Bólu-setningin örvaði sterka IgG1 og IgG4/7 mótefnasvörun sem hindruðu bindingu IgE við ofnæmisvaka. Munur á ónæmissvörun hópanna var mælanlegur í boðefnasvari í kjölfar örvunar á hvítfrumum en ekki í mótefnasvari. Marktækt meiri IFNγ og IL-10 framleiðsla var hjá Alum/MPLA hópnum samanborið við óbólusetta viðmiðunar hesta, þessi munur sást ekki hjá Alum hópnum. Þetta bendir til að Alum/MPLA blandan hvetji Th1/Tstjórnfrumu miðað svar. Þróuð voru byggmél og byggblanda til að meðhöndla hross um munnslímhúð. Heilbrigðir íslenskir hestar voru meðhöndlaðir með byggi sem tjáir ofnæmisvakann Cul n 2. Í kjölfar meðhöndlunar mældust sérvirk IgG1 og IgG4/7 mótefni í sermi og munnvatni. Þau gátu að hluta til hindrað bindingu IgE við Cul n 2 en einnig við Cul o 2 sem er sambærilegt prótein úr C. obsoletus. Mikilvægt er að hafa endurraðaða ofnæmisvaka sem auðvelt er að hreinsa, hafa svipaða þriðja stigs byggingu og eftirbreytni og náttúrulegu próteinin þegar árangur ónæmismeðferðar er metinn og klínísk greining sjúkdómsins staðfest. Byggfræ eru vel til þess fallin að framleiða prótein og fyrir langvarandi geymslu proteina á stöðugu formi. Tveir ofnæmisvakar framleiddir í byggi voru jafn vel fallnir til notkunar í ELISA mótefnaprófi og samsvarandi vakar framleiddir í E.coli og skordýrafrumum. Niðurstöðurnar sýna að bólusetning í eitla með hreinum ofnæmisvökum í blöndu af Alum/MPLA er vænleg leið í þróun á fyrirbyggjandi meðferð gegn sumarexemi og mögulega líka afnæmingu. Enn fremur fengust vísbendingar um að meðhöndlun um slímhúð munns með byggi sem tjáir ofnæmisvaka gæti verið góður valkostur. Þannig væri komist hjá vandasamri sprautun og kostnaðarsamri próteinhreinsun.Rannís, Eimskipasjóður Háskóla Íslands, Rannsóknasjóður Háskóla Íslands, Framleiðnisjóður landbúnaðarins, Hrossaræktarsamtök Suðurlands, VETSUISSE