Desenvolvimento de linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae como plataformas de análise de enzimas e transportadores envolvidos na metabolização de xilose

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017.A produção de etanol de segunda geração depende muito da fermentação da xilose, o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos, pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Mas essa levedura é incapaz de fermentar essa pentose, uma vez que não dispõe de enzimas e transportadores eficientes para a sua metabolização. Assim, é importante identificar enzimas e transportadores de xilose de diferentes organismos para a expressão em células de S. cerevisiae. Contudo, pesquisadores têm demonstrado que essa levedura requer modificações genéticas adicionais para uma efetiva fermentação de xilose; entre elas, a sobre-expressão do gene XKS1 (que codifica a xilulocinase) e a deleção do gene PHO13 (que codifica uma fosfatase alcalina) melhoram a fermentação de xilose em linhagens recombinantes. Assim sendo, o presente trabalho se propôs a desenvolver linhagens de S. cerevisiae recombinantes por meio da sobre-expressão do gene XKS1 e/ou deleção do gene PHO13, com o intuito de que essas linhagens possam ser utilizadas como plataformas para a análise de enzimas e transportadores heterólogos envolvidos no metabolismo da xilose. Primeiramente, foi construída a linhagem ASY-1, com a finalidade de servir como plataforma para testes de enzimas heterólogas, já que esta linhagem foi obtida a partir da sobre-expressão do gene XKS1 na linhagem wild-type CEN.PK2-1C. A seguir, foi construida a linhagem ASY-2, a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem ASY-1. As linhagens CEN.PK2-1C, ASY-1 e ASY-2 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Nossos resultados mostram que a sobre-expressão do gene XKS1 foi necessária para haver consumo de xilose em crescimentos aeróbios e para a produção de etanol a partir dessa pentose em fermentações microaeróbias, indicando que essa sobre-expressão é crucial para o metabolismo da xilose em S. cerevisiae. A deleção do gene PHO13 permitiu um consumo mais rápido e maior da xilose, tanto em crescimentos aeróbios quanto em fermentações microaeróbias, além de ter aumentado a produção de xilitol e alterado a produção de glicerol em todos os ensaios. Ainda, os efeitos vantajosos causados pela deleção do gene PHO13 no consumo de xilose e na produção de etanol se mostraram mais evidentes em meios contendo alta concentração (100 g.L-1) de xilose. Paralelamente, contruímos também a linhagem ASY-3, com a finalidade de servir como plataforma para testes de transportadores heterólogos, sendo que esta linhagem foi construída a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem DLG-K1, uma linhagem hxt-null (hxt1-hxt7 e gal2) que possui os genes necessários à metabolização de xilose sobre-expressos mas incapaz de transportar monossacarídeos. As linhagens DLG-K1 e ASY-3 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam os transportadores Sut4 e Xut1 provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Scheffersomyces stipitis, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Em ensaios de crescimento aeróbios, nossos resultados mostraram que a deleção do gene PHO13 permitiu consumo mais rápido e maior da xilose, além de maior produção de etanol. No entanto, em fermentações microaeróbias, não houve diferença no consumo de xilose entre as linhagens contendo ou não o gene PHO13 e expressando os transportadores heterólogos. A deleção do gene PHO13 também alterou a produção de glicerol pelas cepas em todos os ensaios fermentativos realizados utilizando transportadores heterólogos. Portanto, as linhagens recombinantes desenvolvidas constituem importantes ferramentas para a clonagem e identificação de novos genes envolvidos no transporte e fermentação de xilose por S. cerevisiae.Abstract : Second-generation ethanol production depends greatly on the xylose fermentation, the second most abundant sugar in the lignocellulosic hydrolysates, by the yeast Saccharomyces cerevisiae. But this yeast is incapable of fermenting this pentose, since it does not have efficient enzymes and transporters for its metabolization. Therefore, it is important to identify xylose enzymes and transporters of different organisms for the expression in S. cerevisiae cells. However, researchers have shown that this yeast requires additional genetic modifications for an effective xylose fermentation; among them, XKS1 gene (which encodes xylulokinase) overexpression and PHO13 gene (encoding alkaline phosphatase) deletion to improve xylose fermentation in recombinant strains. Thus, the present work aimed to develop recombinant S. cerevisiae strains by XKS1 gene overexpression and/or PHO13 gene deletion, so that these strains could be used as platforms for the analysis of enzymes and transporters involved in xylose metabolism. Firstly, the ASY-1 lineage was constructed to serve as a platform for heterologous enzyme tests, since this lineage was obtained from the XKS1 gene overexpression in the wild-type strain CEN.PK2-1C. The ASY-2 yeast was then constructed by PHO13 gene deletion in the ASY-1 strain. The CEN.PK2-1C, ASY-1 and ASY-2 strains were transformed with plasmids containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum yeasts, respectively, and the fermentative performance of transformants was evaluated. Our results show that XKS1 gene overexpression was required for xylose consumption in aerobic growths and for ethanol production from this pentose in microaerobic fermentations, indicating that this overexpression is crucial for xylose metabolism in S. cerevisiae. PHO13 gene deletion allowed a faster and greater xylose consumption, both in aerobic growth and microaerobic fermentations, in addition to increasing the production of xylitol and altering the production of glycerol in all the assays. Furthermore, the advantageous effects caused by PHO13 gene deletion on xylose consumption and ethanol production were more evident in media containing high xylose concentrations (100 g.L-1). At the same time, we also built the ASY-3 lineage, in order to serve as a platform for heterologous transporter tests. This strain was constructed by the PHO13 gene deletion in the DLG-K1 strain, a hxt-null yeast (hxt1-hxt7 and gal2) which has the genes necessary for xylose metabolization overexpressed, but incapable of transporting monosaccharides. The DLG-K1 and ASY-3 yeast were transformed with plasmids containing genes encoding the Sut4 and Xut1 transporters from Spathaspora arborariae and Scheffersomyces stipitis yeasts, respectively, and the fermentative performance of the transformants was evaluated. In aerobic growth assays, our results showed that PHO13 gene deletion allowed for faster and greater xylose consumption, in addition to higher ethanol production. However, in microaerobic fermentations, there was no difference in xylose consumption between strains containing or not the PHO13 gene and expressing the heterologous transporters. PHO13 gene deletion also altered glycerol production by the strains in all fermentative assays performed using heterologous transporters. Thus, the developed recombinant strains are an important tool for cloning and identification of new genes involved in xylose transport and fermentation by S. cerevisiae