Role of miR7695 in controlling OsNramp6 (Natural resistance-associated macrophage protein 6) expression and defense responses in rice plants

Los microARNs (mirARNs) son un clase de pequeños ARNs no codificantes que actúan como reguladores de la expresión génica, y juegan un papel determinante en procesos fisiológicos de las plantas, en los que se incluyen procesos del desarrollo, señalización hormonal, y procesos tanto de estrés abiótico como biótico. Esta regulación es llevada a cabo por el reconocimiento específico de RNA mensajeros por complementaridad de secuencias, lo que determina bien la degradación o la represión traduccional de dichos tránscritos diana. Esta tesis aborda la caracterización funcional del miR7695, un nuevo mirARN de arroz cuya diana es el transcrito más corto generado por procesamiento alternativo del tránscrito primario del gen OsNramp6 (Natural-resistance-associated macrophage protein 6), así como su contribución en resistencia a la infección por patógenos en plantas de arroz. Las proteínas pertenecientes a la familia de las NRAMP poseen actividad como transportadores de metales en un amplio rango de organismos, desde bacterias hasta humanos. En este trabajo se describe que miR7695 es un regulador post-transcripcional de OsNramp6 que regula positivamente de la resistencia en plantas de arroz frente a la infección causada por el hongo Magnaporthe oryzae. Este hongo es el causante de la Piriculariosis, una de las enfermedades más importantes para el cultivo del arroz a nivel mundial. Esta tesis esta dividida en dos capítulos. El primer capítulo se centra en el análisis de la expresión de MIR7695 en las plantas de arroz, incluyendo mutantes afectados en la biogénesis de mirARNs. Estos análisis nos permitieron concluir que el mir7695 es un mirARN no descrito anteriormente en plantas que se ha generado recientemente desde el punto de vista evolutivo. La función biológica del mir7695 ha sido demostrado tanto en plantas transgénicas que sobreexpresan su precursor como en un mutante de T-DNA de activación del MIR7695. La acumulación del miR7695, y consiguiente disminución de la expresión de OsNramp6, confiere una mayor resistencia a la infección por el hongo M. oryzae en plantas de arroz. Además, los perfiles de transcripción obtenidos en el mutante de activación del miR7695 muestran cambios transcripcionales en un importante número de genes implicados en la homeostasis del hierro. El segundo capítulo describe la localización subcelular y las propiedades de transporte de la proteínas NRAMP6, designadas como "full-lenght" and "short" en referencia a las dos isoformas de la proteína NRAMP6 (completa y truncada). De ellas, únicamente el transcrito que codifica para la isoforma corta de Nramp6 contiene el sitio diana para el miR7695. Ambas proteínas se localizan en la membrana plasmática y actúan como transportadores de hierro y manganeso. En esta tesis también se describe el papel que juega OsNramp6 en el crecimiento así como en la resistencia frente a la infección por M. oryzae en plantas de arroz. En conclusión, los resultados aquí presentados apoyan la implicación de miR7695/Nramp6 en la inmunidad de arroz, y amplían nuestros conocimientos sobre los procesos moleculares que sustentan las respuestas de defensa de las plantas. Estos estudios son importantes ya que apoyan la idea de que el estado nutricional de las plantas afecta a la resistencia frente a patógenos. Ello, podría ser útil en el diseño de nuevas estrategias para el control de enfermedades en el arroz, un cereal de importancia agronómica en todo el mundo.MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression in a wide range of plant physiological processes, including developmental processes, hormone signaling, and responses to environmental stress, biotic and abiotic stress. That regulation is carried out by triggering sequence-specific cleavage or translational repression of target transcripts. This thesis addresses the functional characterization of miR7695, a novel miRNA from rice that targets an alternatively spliced transcript of the OsNramp6 (Natural-resistance-associated macrophage protein 6) gene, and its contribution to disease resistance in rice. Members of the NRAMP family of proteins are known to function as metal transporters in a wide range of organisms, from bacteria to humans. The involvement of miR7695 through modulation of OsNramp6 transcript accumulation in resistance of rice plants to infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae has been demonstrated. This fungus is the causal agent of the rice blast disease, one of the most important diseases of cultivated rice. This thesis is organized into two chapters. The first chapter focuses on the analyses of MIR7695 expression in rice plants, including mutants impaired in miRNA biogenesis. This analysis allowed us to conclude that miR7695 is a novel, recently evolved miRNA from rice. The biological role of miR7695 was demonstrated in transgenic rice overexpressing the MIR7695 precursor as well as in activation-tagged rice mutants of MIR7695. Accumulation of miR7695, with the concominant down-regulation of OsNramp6 expression, confers enhanced resistance to M. oryzae infection in rice plants. Moreover, global transcript profiling of rice mutants accumulating miR7695 revealed alterations in an important number of genes involved in iron homeostasis. The second chapter describes the subcellular localization and metal transport properties of NRAMP6 proteins, namely the full-length and the short NRAMP6 protein isoforms (only transcripts encoding the short-Nramp6 isoform contain the target site for miR7695). Both NRAMP6 proteins localize to the plasma membrane and function as iron and manganese transporters. A role of OsNramp6 in growth and resistance to infection by M. oryzae is reported. Collectivelly, results here presented support that miR7695/Nramp6 functioning is implicated in rice immunity, and broaden our knowledge about the molecular processes that sustain defense responses in plants. These studies are important to understand how the plant nutritional status affects disease resistance which might be useful in designing novel strategies for disease control in rice, a cereal of agronomic importance worldwide