Valutazione dei livelli trascrizionali e proteici dell'osteopontina in pazienti affetti da epatocarcinoma

Introduzione. Il carcinoma epatocellulare (epatocarcinoma o HCC) è il più frequente tumore primitivo del fegato e rientra tra le prime due cause di morte per tumore nei paesi industrializzati. L’HCC deriva da un processo multifattoriale complesso, dove il fattore di sviluppo importante è la conseguente infiammazione cronica del fegato. Ad oggi l’epatocarcinoma rappresenta un problema di rilevante importanza clinica e la necessità di individuare un biomarcatore che permetta di diagnosticare la neoplasia, fin dalle sue prime fasi di sviluppo, potrebbe portare ad un miglioramento prognostico e terapeutico aumentando le prospettive di vita del paziente stesso. Negli ultimi anni l'osteopontina (OPN), una glicoproteina della matrice extracellulare che svolge il ruolo di citochina è risultata essere coinvolta come fattore prognostico durante lo sviluppo dell’epatocarcinoma. Scopo. Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di valutare, in soggetti affetti da HCC sottoposti a trapianto (riceventi, recipient’s liver RL) e in un gruppo di donatori sani (donatori, donor’s liver, DL), la concentrazione di OPN, sia a livello plasmatico che tessutale, la sua espressione a livello di mRNA insieme a quella delle sue isoforme (OPN-b, OPN-c) ed il fattore di conversione, trombina. Essendo l’OPN una proteina di matrice coinvolta nel danno epatico, è stata inoltre valutata la sua associazione a biomarcatori di cancerogenesi/proliferazione, come Notch-1, Collagene IV-dominio 7s, ed altri biomarcatori infiammatori come l’interleuchina (IL-6) ed il fattore di necrosi tumorale (TNF-α). Materiali e metodi. Il lavoro di Tesi è stato condotto in collaborazione con l’Unità Operativa di Chirurgia Epatica e del Trapianto di fegato dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana dove sono stati arruolati i pazienti. Dal tessuto epatico proveniente da RL (n=10; età 59,4±1,8 anni) e DL (n=14; età 62,1±17,3 anni) è stato estratto l’RNA totale con il metodo della guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio e ne è stata verificata l’integrità, la purezza e la concentrazione. L’espressione a livello di mRNA degli effettori è stata valutata attraverso reazioni di Real-Time PCR previo settaggio delle condizioni ottimali di reazione. Al fine di effettuare una corretta normalizzazione è stato valutato un set di geni di riferimento scelti tra i più studiati in letteratura tra cui i più stabili sono risultati la ciclofilina A (PPIA), il fattore eucariotico di allungamento 1A (eEF1A) e la proteina tumorale a traslazione controllata di tipo 1 (TPT1) con un valore di stabilità pari a M=0,69. Le concentrazioni proteiche e plasmatiche dell’OPN sono state misurate attraverso saggio immunometrico specifico. Risultati. L’espressione a livello di mRNA dei geni analizzati nel tessuto epatico è risultata aumentata nei riceventi rispetto ai donatori. Correlazioni statisticamente significative sono state trovate tra: OPN-a/OPN-b (p<0,0001; r=0,91), OPN-a/trombina (p=0,007; r=0,53), collagene IV-dominio 7S e le varie isoforme [OPN-a: p=0,016; r= 0,51, OPN-b: p=0,044; r= 0,43, OPN-c: p=0,05; r= 0,42], OPN-c/Notch-1 (p=0,004; r= 0,57). Per quanto riguarda la valutazione della concentrazione dell’OPN tessutale e plasmatica, ottenute con la determinazione immunometrica, è stato confermato lo stesso andamento osservato per l’espressione a livello di mRNA, sebbene non si siano osservate differenze significative (OPN estratto tessutale: 123±23 vs. 305±132 pg/ml; OPN plasmatica: 1052±223 vs. 2945±1223 pg/ml). E’ stata inoltre osservata un’importante correlazione positiva tra la concentrazione plasmatica di OPN e quella proteica (p<0,0001, r=0,96), correlazione che si mantiene significativa anche suddividendo i soggetti in RL (p<0,0001, r=0,96) e DL (p