Development and validation of LC-MS/MS method for determination of fentanyl and midazolam in DBS samples

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014Fentanyl and midazolam are two drugs widely used in combination for sedation and analgesic procedures in children. Fentanyl is an analgesic opioid and midazolam is a benzodiazepine of short acting. Caution must be exercised when benzodiazepines and opioids are used together: the risks of hypoxia and apnea are significantly greater than when they are used alone. So, bioanalytical methods with low limit of quantification and high selectivity could be required to control these drugs in hospital environment and particularly in pharmacokinetic studies. In order to improve this necessity, the aim of this work is to develop and try to validate a new method for simultaneous analysis of these two substances in human blood of infants patients under this kind of therapies. The dried blood spots method associated to liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) have been shown a lot of advantages in comparison with the normal techniques. DBS samples were prepared by spotting 20 μL of spiked whole blood onto Protein Saver ™ 903 ™ Whatman ™ cards and drying for at least 2 h. The drug samples were extracted from spots using methanol. Chromatographic separation was performed on a Kinetex 50 mm × 2.1 mm C18 column, using 0,1% formic acid and acetonitrile as mobile phases. The developed method was formed to be accurate, repeatable and selective in the range of linearity from 0,1 to 100 μg/L of fentanyl and from 10 to 4000 μg/L midazolam. The extraction recovery was > 80 % and stability shows good results. However, it was showed a significant matrix effect what mean that a newer confirmation is required. The method was acute, precise and linear and in the future could be successfully used for simultaneous measurements of fentanyl and midazolam concentrations in BDS samples of children patients.O objetivo deste projeto foi a otimização de um método bioanalítico de quantificação do fentanil e do midazolam, a partir de amostras de sangue total na forma de Dried Blood Spots (DBS), com determinação por Cromatografia Líquida acoplada a Espetroscopia de Massas (LC-MS). Os DBS são um método utilizado há mais de 40 anos no rastreio de doenças metabólicas congénitas em recém-nascidos. Este consiste essencialmente na impregnação de uma gota de sangue numa matriz de papel apropriado. O método de DBS oferece inúmeras vantagens, nomeadamente o fato de possibilitar uma colheita menos invasiva do sangue comparada com a colheita tradicional, pois apenas uma gota de sangue já possibilita a análise em DBS, não sendo necessário a colheita de grandes volumes; um armazenamento mais fácil, uma vez que depois de secos os cartões podem ser armazenados á temperatura ambiente apenas com uma proteção de plástico – ou seja, sem a necessidade de refrigeração – e ainda uma menor transferência de amostras tendo em conta que o único passo de manuseamento do sangue acontece na impregnação deste nos cartões que servirão de matriz. Posto isto, o método DBS apresenta-se como adequado para utilização em crianças, por exemplo, onde o volume das amostras disponível é menor e a colheita mais complicada e dolorosa. O facto de o volume da amostra ser pequeno requer também um método com elevada sensibilidade de deteção como é o caso de o método de LC-MS/MS. Nas crianças submetidas a procedimentos terapêuticos ou diagnósticos, um dos aspetos mais importantes e que tem sido desenvolvido substancialmente nos últimos 20 anos, é o manejo da dor e ansiedade. A sedação e analgesia no serviço de emergência pediátrica podem ser realizadas para alívio da dor, diminuição da ansiedade ou ambos, sendo essenciais para o sucesso das intervenções médicas e para o bem-estar da criança. Uma ampla variedade de medicamentos está disponível para proceder á analgesia e sedação em crianças, sendo que não existe um consenso absoluto acerca de quais utilizar. A escolha depende de vários fatores, tais como: as características do paciente, o tipo de procedimento a ser realizado (mais ou menos doloroso) e a sua duração. Uma das abordagens mais comuns em pediatria é a combinação de um analgésico opióide com um sedativo benzodiazepínico como é o caso do fentanil e do midazolam, respetivamente. A monitorização e avaliação apropriadas destes fármacos são cuidados críticos para a segurança e efetividade do procedimento de sedação e analgesia, não só porque estes possuem efeitos tóxicos graves mas também porque as crianças são uma população especial com características específicas de farmacocinética em comparação com os adultos. A monitorização passa normalmente pela avaliação dos sinais vitais da criança, podendo em alguns casos excecionais ser necessário a quantificação da concentração plasmática dos fármacos no sentido de perceber como o organismo está a responder a estes. Assim, o método de DBS - com as suas vantagens descritas - pode trazer alguns benefícios na monitorização de crianças sob analgesia e sedação. Por este motivo, surgiu como relevante criar e otimizar o método apresentado neste trabalho de modo a que este se possa apresentar como uma alternativa vantajosa de quantificação destes fármacos em crianças em meio hospitalar ou em ensaios clínicos. No primeiro passo da otimização, ensaios primordiais foram realizados sem matriz, ou seja, sem DBS e apenas com o solvente enriquecido com os dois fármacos. O solvente também sofreu ajuste, no que diz respeito as percentagens de mistura de reagentes de modo a alcançar a polaridade que conferisse maior afinidade para os fármacos em estudo. O segundo passo da otimização do método foi a criação de uma escala de concentrações que cobrisse o intervalo de concentrações que os dois fármacos atingem na circulação sanguínea possibilitando estabelecer os dez standards finais e construção da curva de calibração. Os intervalos de concentrações cobertos pelos standards são 0,2-100μL para o fentanil e 10-5000μL para o midazolam. Nesse sentido, os DBS foram preparados com aplicação direta nos Agilent DBS cards de 20 μL de sangue total enriquecido com midazolam e fentanil nas concentrações definidas para a curva de calibração. Cada spot foi cortado do cartão e colocado num eppendorff onde lhe foi adicionado o internal standard, sofrendo extração seguidamente com metanol. O extrato recolhido foi quantificado em Agilent 1290 Infinity UHPLC, injetando-se 1 μL na coluna kinetex 50 mm × 2.1 mm × C18. A eluição foi feita com gradiente de acetonitrilo, obtendo-se a resposta após deteção por Agilent 6460 triplo quadruplo ESI-MS/MS. Posteriormente, procedeu-se a avaliação do modelo de regressão linear mais adequado e que representasse melhor o modelo da curva de calibração. O modelo adotado foi o de weighted regression 1/c2 que mostrou boa linearidade (R2>0,99). O passo seguinte foi a validação dos parâmetros que garantem a obtenção de resultados fidedignos aquando da quantificação do midazolam e fentanil por LC-MS/MS. A validação de um método analítico incluí todos os procedimentos efetuados no sentido de confirmar se a determinação quantitativa desse analito, numa dada amostra biológica, é confiável e reprodutível para o uso a que é destinado. Os parâmetros fundamentais para essa validação são: exatidão, precisão, seletividade, reprodutibilidade e estabilidade. Para além destes são também testados o efeito de matriz e a recuperação a partir da amostra. Para análise destes parâmetros foram preparadas quatro quality control samples (QC) com concentrações que refletem valores de concentrações cruciais da curva de calibração. Analisados os resultados da validação conclui-se que, no que diz respeito a exatidão e precisão, o método provou ser robusto e preciso uma vez que os valores obtidos em percentagem de erro relativo em relação ao valor nominal de concentrações e os valores de RSD se encontram dentro do intervalo ±15% tal como o exigido pela FDA. O método apresentou igualmente boa seletividade e boa razão signal to noise avaliado pela sobreposição do cromatograma de um ensaio em branco e do cromatograma do analito relativo ao lower limite of quantification (LLOQ), ou seja, com o valor de concentração mais baixo da curva de calibração. O rendimento da extração mostrou ser >80% para ambos os fármacos, o que pode ser considerado aceitável. Em relação ao efeito da matriz, este revelou-se ligeiramente significativo para a maior parte das QC samples sendo a razão entre resposta obtida com DBS e a resposta obtida sem esta matriz superior a 15% na maior parte dos casos. Tal situação necessitaria de posterior confirmação. Por fim, os testes da estabilidade vieram mostrar que não se observam diferenças na quantificação quer do fentanil quer do midazolam sejam os DBS armazenados durante 15 dias com refrigeração (-20ºC), à temperatura ambiente (25ºC) ou sob aquecimento (37ºC). Isto significa que as amostras poderiam ser guardadas durante pelo menos duas semanas que em qualquer uma destas condições que não iria ocorrer, em princípio, degradação dos fármacos. Para concluir, a validação deste método seria necessário voltar a testar o efeito da matriz na tentativa de perceber porque é que as inconformidades anteriormente referidas se verificam e, obviamente, testar a aplicação do método na análise de amostras reais de sangue recolhido de crianças às quais foram administradas formulações de midazolam e fentanil.Department of Biopharmacy and Pharmacokinetics of Faculty of Pharmacy of University of Ljubljan