Engineeringof Pencillium chrysogenum for enhanced ß-lactam biosynthesis

De ontdekking van penicilline door Alexander Fleming heeft een grote invloed gehad op onze samenleving en de kwaliteit van leven. Tegenwoordig is ook bekend welke genen en de daaraan gekoppelde enzymen verantwoordelijk zijn voor de productie van penicilline in de filamenteuze schimmel Penicillium chrysogenum. Drie van de vier genen die betrokken zijn bij de productie van penicilline liggen bij elkaar in een zogenaamd gencluster (biosynthetisch gencluster). Deze 3 genen zijn: pcbAB dat codeert voor het enzym δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase (ACVS), pcbC coderend voor isopenicillin N synthase (IPNS) en penDE dat codeert voor isopenicillin N acyltransferase (IAT). Daarnaast is er nog een vierde enzym of klasse van enzymen betrokken bij de productie van penicilline. Deze enzymen zijn CoA ligases die verantwoordelijk zijn voor de Coenzym A activatie van zijketen die gebruikt wordt tijdens het productieproces van penicilline. De genen coderende voor deze enzymen liggen niet geclusterd in tegenstelling tot de andere 3 enzymen betrokken bij de productie van penicilline, maar bevinden zich elders in het DNA van P. chrysogenum. Bijvoorbeeld het enzym phenylacetic acid CoA ligase (PCL) gecodeerd door phl is een enzym dat fenylazijnzuur activeert en betrokken is bij de productie van penicilline G. De moderne industriële productie van β-lactam antibiotica is hoofdzakelijk gebaseerd op P. chrysogenum productiestammen die verkregen zijn middels meerdere rondes van klassieke stamverbetering. Dit klassieke stamverbeteringsproces is hoofdzakelijk uitgevoerd door middel van UV behandelingen en behandeling met toxische/mutagene stoffen, waarna er hoofdzakelijk geselecteerd werd op verbeterde penicilline productie onder relevante productieomstandigheden. Analyse van deze verbeterde productiestammen heeft geleid tot de ontdekking van verschillende belangrijke mutaties. Hiervan heeft de vermeerdering van het aantal kopieën van de biosynthetische gencluster de meeste invloed gehad. The discovery of the antibiotic penicillin by Alexander Fleming in 1928 has influenced the quality of life dramatically. Nowadays, also the genetic and enzymological basis of penicillin production by the filamentous fungus Penicillium chrysogenum has been largely resolved. The three penicillin biosynthesis genes involved are clustered: pcbAB which encodes the nonribosomal peptide synthetase δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase (ACVS), pcbC encoding the isopenicillin N synthase (IPNS) and penDE specifying isopenicillin N acyltransferase (IAT). In addition there is a fourth enzyme required for penicillin biosynthesis which is a CoA ligase that activates the side chain precursor used in the production process. These CoA ligase genes are not part of the biosynthetic gene cluster, but located elsewhere in the genome. For instance, the phenylacetic acid CoA ligase (PCL) is encoded by the phl gene and activates phenylacetic acid for penicillin G production. Current industrial production of β-lactam antibiotics is based on improved P. chrysogenum strains that were subjected to successive cycles of classical strain improvement (CSI) using mutagenesis. Genetic analysis of such strains resulted in the identification of several important mutations and genome alterations. Most importantly the amplification of the biosynthetic gene cluster but also mutations that resulted in the elevated expression of the penicillin amino acid precursor biosynthesis pathways, microbody biogenesis and multidrug transporter genes and the inactivation or down regulation of the side chain precursor degradation pathways. Because of the CSI program, current P. chrysogenum production strains can be considered as good cell factories for the production of β-lactam antibiotics. However, selection was during the CSI program mostly based on improved fermentation characteristics and elevated levels of penicillin production. This presumably also resulted in mutations and alterations that are not directly related to penicillin production. Thus, it remains a challenge to fully understand how the process of CSI influenced the current production strains.