Investigations on the epidemiology and diversity of Leishmania tropica and L. aethiopica and the differentiation of their sand fly vectors

Leishmania tropica ist der Auslöser von kutaner Leishmaniose beim Menschen und kommt in Afrika über den Mittleren Osten bis nach Nordindien vor. Mittels Mikrosatellitentypisierung (MLMT) wurde die weltweite Populationsstruktur dieser Spezies und der nahe verwandten Spezies L. aethiopica aufgedeckt, indem sowohl Methoden angewandt wurden, die auf genetischen Distanzen beruhen als auch solche, die auf der Analyse von Allelfrequenzen basieren. Die 195 Stämme von L. tropica sowie die acht Stämme von L. aethiopica gruppierten hauptsächlich gemäß ihrer geographischen Herkunft. Die Stämme von L. aethiopica stellten eine eigene Gruppe dar, die allerdings innerhalb der afrikanischen Stämme von L. tropica gruppierte. Vorläufige Ergebnisse einer genomweiten SNP-Analyse haben die Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse weitgehend bestätigt. Um die Gründe für die hohe genetische Variabilität innerhalb der Spezies L. tropica herauszufinden, wurde eine Funktionelle Klonierung durchgeführt, in der N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) als Indikator für ein funktionierendes oder eingeschränktes Mismatch Repair (MMR)-System eingesetzt wurde. Dafür wurde ein Akzeptorstamm (hohe MNNG-Toleranz) mit einer Cosmidbibliothek, die genomische DNA eines Donorstammes (niedrige MNNG-Toleranz) enthielt, transfiziert. Die erhaltenen Transfektanten wurden dann auf ihre MNNG-Toleranz getestet. Die zeit- und kosteneffiziente Identifizierung von großen Mengen an Sandmücken ist wichtig für Feldstudien, in denen mehrere Tausend Mücken gefangen werden. Hier wird eine multiplexe Technik zur ligationsabhängigen Sondenamplifizierung vorgestellt, die die Identifizierung von Sandmücken-Spezies im Mittleren Osten ermöglicht. Die Spezies Phlebotomus syriacus, P. arabicus und P. papatasi können durch diese Methode mit spezies-spezifischen Sonden eindeutig identifiziert werden. Außerdem kann diese Methode dazu genutzt werden, weitere Spezies zu diskriminieren und auf gepoolte Sandmücken angewandt werden.Leishmania tropica is the causative agent of human cutaneous leishmaniasis in foci ranging from Africa through the Middle East to northern India. By multilocus microsatellite typing (MLMT), the world-wide population structure of this species and its closely related species L. aethiopica has been revealed applying methods based on both genetic distances and allele frequencies. The 195 strains of L. tropica and eight strains of L. aethiopica largely clustered according to their geographical origins. The strains of L. aethiopica formed a distinct group, although clustering among other African strains of L. tropica. Preliminary data obtained through a whole genome sequencing approach including strains of L. tropica, L. aethiopica and L. major have largely corroborated the results of the MLMT approach. To reveal the reasons for the high genetic variability among strains of L. tropica, a Functional Cloning approach was conducted using N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) as an indicator for a functioning or impaired mismatch repair (MMR) system. The transfectants retrieved from the transfection of an acceptor strain exhibiting high MNNG tolerance with a cosmid library bearing the genomic DNA of a donor strain with a reduced MNNG tolerance were screened for the restored phenotype of the donor strain. The time- and cost-efficient identification of a large amount of sand flies is important since several thousands are caught during field studies. Here, a multiplex ligation-dependent probe amplification approach (MLPA) for the identification of sand flies endemic to the Middle East is introduced. The unambiguous identification of Phlebotomus syriacus, P. arabicus and P. papatasi was possible with this approach using species-specific probes. Furthermore, this technique has the potential to discriminate more species and to be applied to pooled sand fly specimens