Untersuchungen zur Effizienz einer CTLA-4Ig Therapie in Kombination mit adoptivem Zelltransfer zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen im Modell der orthotopen Rattenlebertransplantation

Einleitung: CTLA-4Ig blockiert CD28-vermittelte co-stimulatorische Signale und inhibiert kompetitiv in vitro und in vivo immunologische Reaktionen. Der signifikante immunsuppressive Effekt von CTLA4-IG konnte in verschiedenen tierexperimentellen Untersuchungen zur Entwicklung von Toleranz nach Organtransplantation aufgezeigt werden. Allerdings waren die Ergebnisse nach CTLA-4Ig Therapie in den nachfolgenden Untersuchungen variable und ein Großteil der transplantierten Organe wurde letztendlich abgestoßen. Neuere Studien zeigen das die Effizienz der CTLA-4Ig Therapie von dem Zeitpunkt der Gabe abhängen. Weiterhin gibt es Anhalte dafür, daß dieser Effekt durch spenderabgeleitete Transfusionen noch verstärkt werden kann. Für uns stellte sich daher die Frage ob durch die Kombination von CTLA-4IG und Applikation spenderabgeleiteter Splenozyten ein additiver immunsuppressiver Effekt zu erreichen ist und untersuchten dies im Modell der Rattenlebertransplantation (ORLT). Methodik: Wir führten Rattenlebertransplantationen (ORLT) im arterialisierten, voll allogenen Modell Da (RT1a) auf Lew (RT1l) in Standardtechnik durch. Die Ratten erhielten in verschiedenen Gruppen vor/nach der Transplantation CTLA-4Ig oder die Kombination von CTLA-4Ig mit spenderabgeleiteten oder unspezifischen Milzzellen. Ergebnisse: Bei der Vorbehandlung der Empfänger, entweder mit spenderabgeleiteten Zellen oder CTLA-4Ig, ließ sich eine Verbesserung des Transplantatüberlebens, aber keine Langzeitakzeptanz des Transplantates erreichen. Erst die Kombinationstherapie vor der Transplantation gewährleistete ein langfristiges Organüberleben ohne Zeichen für chronische Rejektionen nach mehr als 150 Tagen. Die Therapie mit spenderabgeleiteten Zellen am Tag der Transplantation oder verzögert nach 4 Tagen nach Transplantation veränderte die Überlebenszahlen nicht. Die verzögerte postoperative Therapie mit CTLA-4Ig, wie sie auch von anderen Gruppen durchgeführt wurde, resultierte in unseren Versuchen in einem verlängertem Überleben, führte aber nur bei 2/7 Tieren zur langfristigen Transplantatakzeptanz. Die zusätzliche Applikation nicht abgeleiteter Milzzellen verbesserte die Ergebnisse nicht signifikant. Transplantatakzeptanz bei allen Tieren ließ sich wiederum nur durch die Kombination spenderabgeleiteter Zellen und CTLA-4Ig erreichen. Spenderabgeleiteter Mikrochimärismus trat bei allen Tieren, also auch bei Kontrolltieren trotz ablaufender Abstoßung am 6. POD nach ORLT auf. Am 12. POD zeigten tolerante Gruppen noch spenderabgeleitete Zellen, wohingegen diese bei abstoßenden Gruppen nicht mehr nachweisbar waren. Im Langzeitverlauf waren diese spenderabgeleiteten Zellen auch in toleranten Tieren nur noch vereinzelt nachzuweisen. Eine Verschiebung der Zytokinantwort von TH1- Richtung TH2-Zytokinen konnte bei langfristig überlebenden Tieren nicht aufgezeigt werden. Im Gegenteil, die TH1-Antwort mit INF-g und IL-12b war bei toleranten, kombiniert mit CTLA-4Ig und adoptivem Zelltransfer behandelten Ratten früher und stärker ausgeprägt, aber schneller wieder rückläufig als bei unbehandelten Kontrollen. Dies galt nicht für IL-2, das in allen Gruppen, die mit CTLA-4Ig behandelt wurden, stark unterdrückt war. Langfristig überlebende Tiere zeigten mehr als 150 Tage nach ORLT nahezu keine Expression dieser TH1-Zytokine mehr, wohingegen IL-4 deutlich exprimiert wurde. Dies spricht gegen eine ausschließliche Verschiebung der Zytokinantwort nach TH2 und betont die Bedeutung von TH1-Zytokinen in der initialen Phase der Toleranzentwicklung. In toleranten Tieren mit adoptivem Zelltransfer zeigte sich im Vergleich zu abstoßenden Tieren eine stärkere Ausprägung von Apoptose in den Transplantaten, die zeitlich parallel zu der mRNA-Expression der TH1-Zytokine verlief. Dies läßt darauf schließen, daß Apoptose aktivierter T-Zellen der Mechanismus ist, der die additiven Effekte der CTLA-4Ig-Behandlung und des adoptiven Zelltransfers vermittelt. Die CTLA4-Ig Behandlung verhindert effektiv Abstoßungsepisoden nach ORLT. Die Effizienz der Behandlung kann durch die Applikation von spenderabgeleiteten Zellen noch signifikant verbessert werden. Hierbei spielt die Herunterregulation von IL-2 und Hochregulierung von INF-g eine maßgebliche Rolle, wohingegen der spenderabgeleitete Chimärismus von nachgeordneter Rolle zu sein scheint. Parallel zu dem Nachweis von IFN-g finden sich mehr apoptotische Zellen am Tag 6 in den Transplantaten der später toleranten Ratten, verglichen mit den abstoßenden Kontrolltieren. Dies weist in diesem Modell, im Gegensatz zu anderen Theorien, auf einen immunaktivierten Mechanismus mit nachfolgender Apoptose aktivierter Lymphozyten hinBlockage of co-stimulatory CD28-mediated signals by CTLA4-Ig inhibits in vitro and in vivo immune responses. However, in recent trials monotherapy with CTLA4-Ig failed to introduce long-term survival in several animal transplant models. The study was conducted to investigate the effectiveness of CTLA-4Ig treatment with additional application of donor splenocytes in preventing rejection and improving graft function in rat liver allografts. DA rats (RT1a) were used as donors and Lew (RT1l) rats as recipients in an orthotopic liver transplantation model (ORLT). Recipients were divided in 3 groups depending on the start of treatment: The first group was treated prior to transplantation with CTLA-4Ig (0.5 mg i.p.) alone or in combination with donor derived or donor unspecific 2.5 x 108 splenocytes. The second group was treated simultaneously at transplantation with CTLA-4Ig or received no further treatment and served as controls. The third group received an ORLT and was treated postoperatively on day 3 and 4 with CTLA4-Ig alone or in combination with donor derived or unspecific spleen cells. Only the combination of CTLA-4Ig and donor derived cells pre- or postoperatively led to a 100% graft survival in the long-term. The treatment with CTLA-4Ig alone at each time point led to prolonged graft survival but not to a long-term graft survival. The additional administration of donor unspecific cells could improve these results, however, the differences were not significantly different between these groups. All rats without any treatment died within 12 days after ORLT. When treating the rats with donor derived spleen cells prior to transplantation the survival was significantly prolonged. The application of donor unspecific cells alone pre- and postoperatively had no effect on the survival rates. Microscopic and macroscopic studies of the liver demonstrated no signs of ongoing rejection after 150 days in rats treated with the combination of CTLA4-Ig and donor derived cells. All other long term survivors demonstrated signs of chronic rejection with bile duct loss. Immunohistological staining for DA specific surface antigen demonstrated donor specific chimerism with no predominance in any group. In the early postoperative course, the expression of IL-2 in liver specimen was significantly reduced in all groups receiving CTLA-4Ig. In contrast to this the tolerant rats surviving long-term showed a marked expression of IFN-g in the early course after ORLT. Additionally, these rats showed on day 6 after ORLT more apoptosis in the liver graft specimens compared to rejecting controls. CTLA4-Ig treatment is highly effective in rat liver transplantation and ensure long term survival. Pretransplant or delayed treatment with CTLA4-Ig alone prolongs survival but does not introduce long term tolerance. The effectiveness of the treatment can be markedly improved by the additional application of donor derived cells. The downregulation of IL-2 is mainly involved in the development of tolerance whereas detection of donor specific chimerism is not correlated to the development of tolerance in our study. Additionally an activation induced cell death via IFN-g may be involved in the tolerance induction. Although the mechanisms are still not completely understood immunomodulation by adaptive cell transfer and costimulatory blockage is an interesting and promising option for the future of clinical liver transplantation